Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, küçük molekül indüksiyonu kullanarak pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden doğrudan ve münhasıran nöronal progenitör türetmektir. Bu işlem, tanımlanmış koşullar altında tutulan diferansiye olmamış hücrelere retinoik asit eklenerek gerçekleştirilir. Ardından, hücrelerin nöroblast adı verilen yüzen hücresel kümeler oluşturduğu bir süspansiyon kültürüne aktarılmasıyla diferansiyasyon süreci devam ettirilir.

Nöroblastların nöro farklılaşma ortamında bir doku kültürü plakasına tutunmalarına izin verilirse, olgun nöronların özelliklerini geliştirirler. Nihayetinde, retinoik asit tedavisinin işlem görmüş insan embriyonik kök hücrelerinin morfolojisi ve belirteç ekspresyonu üzerindeki etkisini göstermek için immünofloresan ve dekonvolüsyon veya konfokal mikroskopi kullanılabilir. Diğer tekniklerde, hücrelerin sadece küçük bir kısmı nöronal bir fenotip izlerken, bizim yöntemimiz küçük moleküllerin basitçe sağlanmasıyla, pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinin münhasıran nöronal bir soy hattına doğru iyi kontrollü ve verimli bir şekilde indüklenmesine olanak tanır.

Stok çözeltiler hazırlanırken dikkat edilmesi gereken birkaç adım vardır. Matrigel ve insan laminininin -80 °C'den 4 °C'ye gece boyunca yavaşça çözündüğünden emin olun; saklama medyasını 4 °C'de tutun ve medyayı kullanmadan önce her zaman 37 °C'ye ısıtın. Ayrıca, insan ESL medyası hazırlanırken, bazı takviyeler hemen kullanım öncesinde eklenir.

Bunlar arasında BFGF, askorbik asit, A'da aktif insan insülini ve transferrin yer alır. Ardından, plak kaplamasından hemen önce matrigel veya insan laminin çalışma çözeltilerini hazırlayın. Jelatin ile ön kaplanmış doku kültürü plakları hazırlandıktan sonra, plakları 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin.

Jelatin yerine matrigel veya laminin çalışma çözeltisi kullanılabilir. Bu plakaları dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe ederek kaplayın. İnsan ES hücre kolonilerinin beş ila yedi gün boyunca büyümesine izin vererek başlayın ve ardından bölme işlemine hazırlanın.

%75'ten fazla farklılaşmamış insan ES hücreleri içeren kolonileri seçin; bunlar genellikle belirgin kenarlı ve yığılmış hücreler içeren, hafif opak kolonilerdir. Farklılaşmanın başladığının bir göstergesi olan beyaz koloniler genellikle çoğunlukla farklılaşmış hücreler içerir ve şeffaf görünürler. Beyaz veya şeffaf kolonileri seçmeyin.

Plakaları ışığa tutun ve bir marker kullanarak plakaların tabanındaki hafif opak kolonilerin dış hatlarını belirleyin. Çevredeki fibroblast tabakasını insan ES hücre kolonisinden ayırmak için steril bir P2 pipet ucunun kenarını kullanın. Ardından, çevredeki fibroblast hücrelerini ve koloninin tüm farklılaşmış kısımlarını uzaklaştırın.

Şimdi, ayrılmış diferansiye hücreleri içeren eski medyumu aspire ederek uzaklaştırın. Ardından her kuyucuktaki diferansiye olmamış hücreleri, BFGF içermeyen insan E es hücresi medyumu ile bir kez yıkayın ve ardından üç mililitre, kullanımından hemen önce taze medyuma B-F-G-F eklenmiş taze insan ESL medyumu ekleyin. Şimdi, kolonileri küçük parçalara bölmek ve onları plakadan ayırmak için steril bir P iki pipet ucu kullanın.

Ayrılmış koloni parçalarını ortamlarıyla birlikte 50 milliliter'lik konik bir tüpe alın. Kuyucuk başına ek olarak 1 milliliter ortam ile durulama yapın.

Hücreler artık küçük moleküller kullanılarak yapılacak ileri farklılaşma işlemi için hazırdır. İşleme, yeni kaplanmış plakaların 37 °C'ye ısıtılmasıyla başlayın. Plakalardaki kaplama solüsyonunu aspire edin ve her bir kuyucuğa koloni parçaları içeren dört mL medya ekleyin, ardından plakaları sarsmadan nazikçe bir inkübatöre aktarın.

Hücrelerin tutunmasına izin vermek için plakaları rahatsız etmeyin. Üç günlük tutunma sürecinden sonra, omic asit içeren yeni ortam hazırlayın. Ardından, hücrelerin tamamen batık kalmasını sağlayacak kadar ortam bırakarak eski ortamın çoğunu uzaklaştırın.

Hücrelerin her bir kuyucukta kurumasına asla izin verilmemelidir. BFGF ve retinoik asit içeren dört mililitre taze insan ES hücresi medyumu ekleyin. Medyumu gün aşırı değiştirin ve retinoik asit ile işlem görmüş insan ES hücresi kolonilerinin büyümesini sağlayın.

Yedi veya sekiz gün sonra, hücreler morfolojik değişiklikler geçirerek büyük diferansiye hücrelere dönüşecektir. Ardından, bir süspansiyon hücre kültürü hazırlama işlemine geçiniz; süspansiyon kültürünü başlatmak için ESL kolonilerini, kendiliğinden diferansiye olmuş ve göç ederek bir fibroblast tabakası oluşturmuş hücrelerden ayırınız. Daha önce belirtilen tekniği steril bir pipet ucuyla uygulayınız, ardından yüzen ayrılmış fibroblast hücrelerini içeren eski medyumu aspire ederek uzaklaştırınız.

Hücreleri bir kez HESC besiyeri ile yıkayın ve üç mililitre HESC besiyeri içinde yeniden süspanse edin. Şimdi steril bir P2 pipet ucu kullanarak kolonileri küçük parçalara ayırın ve plakadan koparın.

Ayrık kolonileri içeren medyumu tek bir 50 ml'lik konik tüpe çekin. Kuyucukları bir mililitre medyum ile durulayın ve durulama sıvısını toplama tüpüne ekleyin. Ardından, havuzlanmış hücrelerden dört mililitrelik alikotları, ultra-düşük tutunumlu altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa aktarın ve plağı dört ila beş gün boyunca bir inkübatörde tutun.

Bu süre zarfında, nöroblastın daha olgun bir nöronal fenotipe ilerlemesini sağlamak için yüzen hücresel kümeler veya nöroblastlar oluşacaktır. Bunları içeren medyumu 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin. Ardından hücreleri 1.400 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Eski medyayı aspire edin, mümkün olduğunca çok miktarda tartın ve üzerine VEGF NT-3 ve BDNF içeren eşit miktarda taze NSC medyumu ekleyin. Pipetleme yoluyla hücreleri bir süspansiyon haline getirin, ardından altı kuyucuklu doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna süspansiyondan dört mililitre씩 paylaştırın. Plakaları 37 °C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.

Nöroblastların Matrigel veya insan laminatı içeren bir süspansiyonda 3D kültür için kültür plaklarına gece boyunca yapışması sağlanır. Ve 3D matris 37 °C'de polimerize olur. Besiyerini gün aşırı değiştirin.

İki hafta içerisinde, nörit taşıyan nöronal hücrelerin ve pigmente hücrelerin geniş ağları ortaya çıkacaktır; bu durum, tanımlanmış kültür sisteminde tutulan insan ES hücrelerinin plüripotensiden münhasıran nöroepidermal bir fenotipe geçişini tetiklemek için retinoik asidin yeterli olduğunu gösterir. Diferansiye olmamış insan ES hücreleri retinoik asite maruz kaldığında, koloni içindeki tüm hücreler, plüripotensle ilişkili marker olan OCT four ekspresini durduran büyük diferansiye hücrelere doğru morfolojik değişiklikler geçirmiştir. Hücreler ayrıca HNK one a, P two ve TRKC gibi çeşitli nöroektoderm ilişkili markerları eksprese etmeye başlamıştır.

Bu büyük diferansiye hücreler çoğalmaya devam etti ve koloniler, erken nöronal belirteç beta three tubulin'i spontan olarak eksprese ederek boyutlarını artırdı. Hücrelerin üst üste yığıldığı koloni bölgelerinde, daha olgun nöronal belirteç map two görülmeye başladı. Nöroektodermal hücrelerin ortaya çıkışıyla eş zamanlı olarak, dopaminerjik nöronal diferansiyasyon ve tirozin hidroksilaz geni aktivasyonunda rol oynayan nörona özgü transkripsiyon faktörü NER one, çekirdeğe transloke oldu.

Ayrılmanın ardından, retinoik asit ile işlem görmüş insan ES hücreleri, temel FGF'nin kaldırılmasıyla süspansiyon kültüründe nöroblastlar oluşturmuştur; nöroblastların bir doku kültürü plakasına tutunmasına izin verilmesinin ardından, MSS için tipik olan nörit taşıyan nöronal hücrelerin ve pigmente hücrelerin kapsamlı ağları, verimlilikte sert bir artışla birlikte görünmeye başlamış ve üç ay boyunca kültüre edilebilmiştir. Bu insan ES hücrelerinden türetilen nöronal hücreler, retinoik asit işlemi görmemiş hücrelerin spontan çoklu hat farklılaşmasına kıyasla beta üç tubulin eksprese etmiş ve map iki ile birlikte ko-eksprese etmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde plüripoten insan embriyonik kök hücrelerinden yaklaşık dört hafta içinde tekdüze bir şekilde nöronal progenitörler ve nöronal hücreler üretmek için kullanılabilir.

İnsan hücreleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirmeden önce hücre hatlarının patojen ve mikoplazma içermediğinden emin olmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.