Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama
25 Ekim 2011
Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein ekspresyonundaki heterojenlik derecesine sayısal bir değer atamak için insan kanseri tüm doku kesitlerinde biyobelirteç ekspresyonunu doğru bir şekilde nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle kanser dokusunun immünofloresan işaretli kesitlerinin bir tüm slayt floresan tarayıcı kullanılarak taranmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tümör içindeki ilgi bölgeleri değerlendirme için seçilir.
Ardından, invaziv tümör alanlarındaki ilgili proteinin ekspresyonu, aqua analiz otomatik görüntü analiz sistemi kullanılarak nicelleştirilir. Nihayetinde bu yöntem, doku kesiti boyunca genellikle çok heterojen olan kanser dokusundaki biyobelirteç ekspresyonunu haritalamak için kullanılabilir. Bu tekniklerin, renkli ve metrik görselleştirme reaktifleri kullanan immünohistokimya gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, immünofloresansın daha kantitatif ve daha hassas olmasıdır.
Bu analitik yöntemlerin bütün bir kesit üzerindeki immünofloresan tarama ile birleştirilmesi, dokular genelindeki biyobelirteç ekspresyonundaki ince varyasyonların detaylı haritalanmasını sağlar. Bu prosedürler ilk kez, Histo RX laboratuvarı operasyon direktörü Mark Gustafson tarafından gösterilmektedir. Kanser doku biyopsisinin mikrotom ile kesilmesinin ve numunenin ilgili biyobelirteçlerin ekspresyonu için immünofloresan boyamasının ardından, boyanmış kesitlerin bulunduğu beş adede kadar lamı lam tarayıcının lam kasetine yerleştirin.
Ardından, tarama kapsamı konsolundaki arayüzü kullanarak, boyama paternine veya örneğin diğer gözlemlenebilir özelliklerine bakılmaksızın, her lam için lam üzerindeki tüm dokuyu kapsayacak bir bölge seçin. Sonrasında, tarama kapsamı konsolunu kullanarak, en iyi temsili sağlamak amacıyla, öncelikle dokunun ideal olarak tümör bölgesi içinde yer alan bir doku bölgesini değerlendirmek için seçin.
Şimdi, tarama mikroskobu konsolunun otomatik pozlama özelliğini kullanarak, görüntü odağıyla birlikte her kanal için pozlama süresini belirleyin; düz alan düzeltme görüntülerinin alınacağı arka plan alanını tanımlamak için, tarama mikroskobu konsolu görüntüsü üzerindeki mavi elması kullanarak dokudan uzak ancak hala lam üzerindeki lamelle örtülü bölge içinde olan ek bir bölge seçin. Görüntü yakalamayı optimize etmek için her filtre için doku alanına sarı karelerle temsil edilen odak noktaları ekleyin. Görüntülerde yüksek arka plan veya diğer görüntü artefaktları görülürse, görüntü bölgesi kaydırılmalı ve yeni görüntüler alınmalıdır.
Ardından doku taranır ve elde edilen dijital lam görüntüleri otomatik olarak Aperio spectrum veri tabanına yüklenir. Spectrum veri tabanındaki dijital lam listesinden analiz edilecek lamı seçmek için spectrum programındaki küçük resme çift tıklayın. Daha sonra, beraberindeki H ve D işaretli görüntüyü kullanarak, floresan görüntü üzerindeki ilgi bölgesini işaretleyin.
Tek bir örnek üzerinde, bireysel dairelerle belirlenmiş birden fazla ilgi alanı seçilebilir. İşaretlenmiş görüntüler otomatik olarak spektrum veri tabanına kaydedilir. Şimdi ekranın üst kısmındaki menü çubuğundan Analyze seçeneğini seçin; analiz penceresi göründüğünde, açılır menüden histo RX aqua analysis seçeneğini seçin.
Başlamaya hazır olduğunuzda analiz butonuna basın; Windows görev çubuğunda, görüntülerin Spectrum veritabanından yerel bilgisayara aktarım ilerlemesini gösteren küçültülmüş bir konsol penceresi görünecektir. Veriler aktarıldıktan sonra, örnek için belirlenen ilk eşik değer olan pan sitokeratin görüntü sinyalinin arka plan görüntü sinyalinin üzerindeki veri kümelemesine dayalı, gözetimsiz bir aqua puanlama algoritması kullanarak aqua skoru oluşturmak için aqua analizi başlatılacaktır. Bu işlem, daha sonraki hesaplamalarda kullanılabilen bir tümör maskesi tanımlamak için piksellerin kullanılmasına olanak tanıyacaktır.
Tüm sitokeratinin yüksek ekspresyon gösterdiği pikselleri, aynı zamanda tümör hücrelerinin sitoplazmik veya nükleer olmayan bölgelerini tanımlamak için kullanın. Burada görüldüğü gibi, tümör maskesi içinde yer alan ve DPI kanalında yüksek sinyale sahip olan pikseller, doğası gereği nükleer olarak tanımlanır. İnceleme sırasında, örnek veya görüntüleme artefaktları nedeniyle skorlama için uygun olmayan alanlar tespit edilirse, bu alanlar skorlamadan çıkarılır ve nihai sonuçta başarısız olarak kaydedilir.
Aqua skorlama sonuçları, tüm doku kesiti örneği içindeki ilgi bölgesinde bulunan her bir 512 x 512 piksellik karo ile ilişkili skorlardan oluşan bir tablo olarak sunulur; bu tablo kaydedilebilir ve sonraki istatistiksel analizler için kullanılabilir. Hematoksilin ve eozin boyalı bu fotomikrograflar, aynı over kanserinin farklı bölgelerinin nasıl değişken morfolojiler sergileyebileceğini göstermektedir. Şekil B'nin sağ üst köşesindeki yüksek büyütmeli görünüm, tümörün üst kısmındaki sitoplazmik açıklığa sahip hücreleri ve solid büyüme paternini vurgulamaktadır.
Ancak, Şekil C'nin sağ alt bölümünde büyütülmüş olan dokunun alt kısmı, daha homojen bir eozinofilik sitoplazmaya ve papiller bir büyüme paternine sahiptir. Burada, üst ve alt panellerde sırasıyla kemoterapi tedavisi öncesi ve sonrası bir over kanseri doku kesitindeki ER ekspresyonunun heterojenite ısı haritaları gösterilmiştir. Üst şekildeki kesit boyunca hem yüksek hem de düşük ekspresyon bölgeleriyle seyreden değişken ER ekspresyonundan, alt şekilde kırmızı ile gösterilen yüksek ER ekspresyonunun homojen dağılımına geçişe dikkat ediniz.
Bu değişimin sayısal gösterimi, solda Simpson indeksindeki düşüş ile belirtilmiştir. Bu şekilde, over kanserinin bir doku kesitindeki HER two heterojenite ısı haritaları, sırasıyla üst ve alt panellerde görüldüğü üzere terapi öncesi ve sonrası yeniden gösterilmiştir. Üstteki şekildeki kesit boyunca hem yüksek hem de düşük ekspresyon bölgeleriyle seyreden değişken HER two ekspresyonunun, alttaki şekilde yüksek HER two ekspresyonunun homojen bir dağılımına dönüştüğünü tekrar göz önünde bulundurunuz.
Simpson indeksinin bir kez daha azaldığı görülmektedir. Bu prosedür uygulanırken, hesaplamalı analiz tarafından üretilen verilerin kalitesinin yalnızca boyama kalitesi kadar iyi olduğu ve boyamanın yüksek bir teknik standartta olması gerektiği unutulmamalıdır.
Genel Bakış
Bu makale, kantitatif immünofloresan ve görüntü analizi kullanarak tümör histolojik kesitlerindeki moleküler heterojenliğin nicelleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, protein ekspresyonundaki heterojenliğin istatistiksel bir ölçümünü sağlayarak klinik biyobelirteç geliştirmeyi geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- İmmünoloji
Arka Plan
- Biyobelirteç ekspresyonunun nicelleştirilmesi, kanser araştırmalarında kritik öneme sahiptir.
- İmmünohistokimya gibi geleneksel yöntemler, hassasiyet ve nicelleştirme açısından sınırlamalara sahiptir.
- İmmünofloresan, protein ekspresyonunu değerlendirmek için daha kantitatif bir yaklaşım sunar.
- Tümörlerdeki heterojenliğin anlaşılması, tedavi stratejilerine ışık tutabilir.
Çalışmanın Amacı
- Tüm doku kesitlerinde biyobelirteç ekspresyonunu doğru bir şekilde nicelendirmek.
- Protein ekspresyonundaki heterojenlik derecesine sayısal değerler atamak.
- Heterojen kanser dokularında biyobelirteç ekspresyonunun haritalanmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tüm slayt tarayıcı kullanarak immünofloresan işaretli doku kesitlerinin taranması.
- Değerlendirme için tümör içindeki ilgi bölgelerinin seçilmesi.
- Aqua analiz otomatik görüntü analiz sistemi kullanılarak protein ekspresyonunun nicelendirilmesi.
- Biyobelirteç ekspresyonundaki değişiklikleri görselleştirmek için heterojenlik ısı haritalarının oluşturulması.
Temel Sonuçlar
- Kanser dokuları genelindeki biyobelirteç ekspresyon varyasyonlarını haritalama yeteneği kanıtlanmıştır.
- Kemoterapi tedavisi öncesi ve sonrası ekspresyon modellerindeki değişiklikler gösterilmiştir.
- Simpson indeksi kullanılarak heterojenliğin kantitatif bir değerlendirmesi sağlanmıştır.
- İmmünofloresansın geleneksel yöntemlere göre avantajları vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, tümörlerdeki biyobelirteç heterojenliğinin anlaşılmasını geliştirir.
- Klinik uygulamalar için daha hassas ve kantitatif bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik, biyobelirteç ekspresyonuna dayalı hedefli tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Uygunluğu
Tümörlerdeki protein ekspresyonunun uzamsal heterojenliğinin nicelleştirilmesi, geleneksel toplu veya yarı nicel yöntemlerin, terapötik yanıtı ve direnci etkileyebilecek alt popülasyon düzeyindeki değişkenliği maskelediği biyobelirteç odaklı ilaç geliştirme süreçlerindeki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Biyobelirteç dağılımının sayısal ve uzamsal olarak çözümlenmiş bir ölçümünü sağlayan bu yöntem, daha hassas bir hasta stratifikasyonuna olanak tanır; hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerinde mekanistik risk azaltmayı destekler. Yöntemin over kanserinde ER ve HER2 üzerindeki uygulaması, endokrin ve hedefli tedavi yanıt öngörüsüyle doğrudan ilişkili olduğunu kanıtlayarak, preklinik ve erken klinik programlardaki devam/durdurma kararlarına ışık tutmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulama çalışmalarında biyobelirteç ekspresyon heterojenliğini bağımsız bir değişken olarak haritalayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Gözlemlenen biyobelirteç seviyelerinin tekdüze bir hedef etkileşimini mi yansıttığını yoksa intratümöral değişkenlik nedeniyle mi karıştığını ortaya çıkararak fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Öngörücü Değer: Tümör bölgeleri genelinde tutarlı ilaç yanıtları verme olasılığı daha yüksek olan homojen ekspresyon modellerine sahip hedefleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini geliştirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: İmmünofloresan tabanlı analizlerin geliştirilmesi ve standardize edilmesi için kantitatif referans noktaları sağlayan, doğrulanmış ve mekansal olarak çözümlenmiş protein ekspresyon haritaları oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Gözlemci yanlılığını minimize etmek ve doku kesitleri ile deneysel gruplar arasında tutarlı kantifikasyon sağlamak için otomatik döşeme (tiling) ve AQUA skorlaması kullanır.
- Tarama Ölçeklenebilirliği: Yüksek içerikli analiz iş akışlarıyla uyumlu döşeme düzeyinde veriler üreterek, bileşiklerin biyobelirteç dağılımı üzerindeki etkilerinin ölçeklenebilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Terapötik müdahale öncesi ve sonrası biyobelirteç stabilitesini değerlendirmek için hastalığa özgü bir sistem sağlayarak, keşif aşamasındaki heterojenite ölçümlerini preklinik doğrulama ile ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Kemoterapi öncesi ve sonrası ER ve HER2 ekspresyon heterojenitesindeki değişiklikleri niceliklendirerek, tedavi kaynaklı fenotipik kaymalar için öngörücü bir biyobelirteç sunar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Terapötik etkilerin tekdüze mi yoksa seçici mi olduğunu belirleyerek, öngörülemeyen dirençli subklonlar nedeniyle ortaya çıkan geç aşama başarısızlıkları azaltır ve go/no-go (devam/tamam) kararlarını destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle uzamsal ekspresyon modellerinin ilaç etkinliğini ve direnç mekanizmalarını etkilediği biyobelirteç odaklı tedaviler için; hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Tümör biyolojisi ve sinyal yolaklarının mekanistik çalışmalarında bir değişken olarak protein ekspresyon heterojenliğinin nicelleştirilmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Heterojen tümör modellerinde tekrarlanabilir bileşik taramasını kolaylaştıran, analize hazır nicel çıktılar (karoda AQUA skorları) sağlar.
- Analitik: Koşulları karşılaştırmak ve ekspresyon değişimlerini zaman içinde veya tedaviye bağlı olarak takip etmek için istatistiksel metrikler sunan heterojenlik ısı haritaları ve Simpson indeksinden türetilmiş skorlar oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç ekspresyonunun tedavi sonrası nasıl değiştiğini göstererek preklinik süreklilikle bağ kurar ve farmakodinamik izleme stratejilerine bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kanser türleri ve biyobelirteçler genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz platformu kurarak gereksiz yöntem geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Ölçülmeyen intratümöral heterojenlikten kaynaklanan mekanistik belirsizliği azaltarak, biyobelirteç ilgisine yönelik öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik görüntü analizi ve valide edilmiş boyama protokolleri aracılığıyla standartlaştırılmış, tekrarlanabilir nicelendirme sağlar.
- Stratejik Değer: Tekdüze ekspresiyona sahip biyobelirteçlerin daha erken tanımlanmasını sağlayarak, heterojen hedef mevcudiyeti nedeniyle başarısız olma olasılığı yüksek olan hedeflere yapılan yatırımı azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Heterojenliğin kötü prognoz veya değişken tedavi yanıtı ile korele olduğu biyobelirteçleri vurgulayarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeye temel oluşturur.
Uygulama Hususları
- İmmünofloresan boyama, tüm lam tarama ve AQUA tabanlı görüntü analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek kaliteli, multipleks immünofloresan boyamaya ve spektral ayrıştırma özelliklerine sahip bir tüm lam floresan tarayıcıya bağımlıdır.
- Laboratuvarlar arası karşılaştırılabilirliği sağlamak için ilgi bölgesi seçimi ve arka plan düzeltmesine yönelik standartlaştırılmış protokoller gerektirir.
- Alternatif model sistemlerine (örneğin, zenograftlar, organoidler) adaptasyon, epitel maskeleme ve sinyal segmentasyon parametrelerinin doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, düşük bolluktaki hedeflerde kantifikasyon doğruluğunu etkileyebilen antikor özgüllüğüne ve sinyal-gürültü oranına olan bağımlılık yer alır.
