Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit

Bu prosedürün genel amacı, vajinal fungal yükü nicelleştirmenin bir yolu olarak vajinal kandidiyazis deneysel hayvan modelinin kullanımına ilişkin spesifik prosedür sorunlarını göstermek ve ayrıca vajinal veya lenfoid hücreleri immünolojik ve histolojik analizler gibi spesifik analizlerde kullanmaktır. Bu, öncelikle östrojen uygulanmış farelerde vajinal inokülasyon tekniğinin gösterilmesiyle gerçekleştirilecektir. Ardından, fare ötanize edildikten sonra, kandida geri kazanımı için vajinal lavaj uygulanacaktır.

Ardından vajinal doku ve/veya vajinal drenaj lenf düğümleri çıkarılacaktır. Lavaj sıvısı, vajinal epitelyal hücrelerle ilişkili candida'yı göstermek için mikroskop altında incelenebilir veya vajinal fungal yükü nicelleştirmek için agara ekilebilir. Hücresel fraksiyonun bir yayması, epitelyal hücrelerin ve lenfoid hücrelerin boyanması için de kullanılabilir.

Bu tekniğin gösterilmesinin temel amacı, vajinit hayvan modelini kullananların bu işlemi en verimli ve etkili şekilde gerçekleştirmelerini sağlamaktır. Teknik aracılığıyla yanıtlanan temel sorular; konakçı bağışıklık yanıtları, hücresel dağılım, ilaç etkinliği, immünoterapötik etkinlik ve ayrıca bağışıklamanın etkileri gibi vajinit ve ekoloji alanındaki kritik soruları kapsamaktadır. Bugün, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Junco Yano, beta estradiol enjeksiyonundan üç gün sonra bir fareyi C. albicans ile enfekte edecektir.

Fareyi, tutunabilmesi için düz bir gRED yüzeyine sabitleyerek başlayın. Ardından, kuyruğun tabanını iki parmağınızla tutun ve vajinal açıklık size bakacak şekilde kalçayı yukarı kaldırın. Pipet ucunu vajinal lümene yaklaşık beş milimetre derinliğinde yerleştirin ve 20 µL kadar inokülüm süspansiyonu çekin.

Faredeki stresi en aza indirmek için bu adımı mümkün olduğunca hızlı ve nazik bir şekilde tamamlayın. İstenen inkübasyon süresinden sonra, hayvanı tesisinizin protokolüne uygun olarak ötanize edin. Ardından, vajinal açıklığın bir pipetle erişilebilir hale gelmesi için fareyi kuyruk tabanından iki parmağınızla aşağıya doğru tutun.

Vajinal lümene 100 µL steril PBS ekleyin ve tekrarlanan aspirasyon ile ajitasyonla lavaj gerçekleştirin. Pipet ucu hücrelerle tıkanırsa, tıkanıklığa neden olan hücreleri boşaltın ve kalan PBS ile lavaja devam edin. Lavaj sıvısını bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.

Vajinal lavaj prosedürünün ardından, fareyi sırtüstü yatırın ve kasık bölgesini %70 etanol ile doyurun. Bir penset kullanarak, vajinal açıklığın açığa çıkması için idrar deliğini yukarı kaldırın. Kavisli bir penset çiftini vajinal lümene yerleştirin ve pensetle sıkıca kavrayarak serviksi bulun.

Serviksi vajinal boşluk aracılığıyla çıkarın, vajinayı vajinal açıklığın tabanından eksize edin ve ardından serviksi cerrahi makas yardımıyla vajinadan ayırın. Vajinal doku involüsyon geçirdiği için, orijinal oryantasyonu korumak adına dokuyu ters çevirin veya hayvan sırtüstü pozisyondayken lomber nod eksize etmek için lateral bir insizyon yaparak dokuyu bir levha şeklinde açın. Karın bölgesini %70 ethanol ile doyurun.

Alt karından göğse doğru lateral bir insizyon yapın ve her iki elinizdeki forsepler yardımıyla iç organları açığa çıkarın. Merkezi kan damarları görünür hale gelene kadar bağırsakları yukarı doğru kaydırın. Vena cava inferior ve abdominal aortayı belirleyin.

Bir çift lomber lenf nodu, abdominal aortun bitişiğinde, renal arterlerin ve ortak iliak arterlerin başlangıç noktaları arasındaki yaklaşık orta mesafede tanımlanabilir. Bu lenf nodları, elastik dokuları sayesinde yağ dokusundan görsel olarak ayırt edilebilirler; yağ dokusuna kıyasla renkleri daha açık ve daha opaktır. Ayrıca, enfekte hayvanlarda, inoküle edilmemiş olanlara göre belirgin şekilde daha büyüktürler.

Mikro pensleri lenf düğümünün altına yerleştirip ardından çevre dokudan ayırmak için nazikçe yukarı çekerek hayvanların lenf düğümleri çıkarıldı. Dokuyu çıkardıktan sonra lenf düğümlerini, yaklaşık 10 mililitre Hank's dengeli tuz çözeltisi içeren steril bir cam Petri kabının içine yerleştirilmiş steril bir tel süzgecin üzerine aktarın. Lenfoid hücreleri izole etmek için yazılı protokole bakın.

En az dört gün önce inoküle edilmiş farelerden alınan vajinal lavaj sıvısının hücresel fraksiyonları, burada yaş preparat mikroskopisi ile gösterildiği üzere, tipik olarak candida epitel hücreleri ve hücresel infiltratlardan oluşur. Candida, mayaların yanı sıra PHA varlığı ile tanımlanabilir. Burada vajinal lavaj sıvısının yayma preparatları boyanmıştır.

Pap smear tekniği kullanılarak, tri-nükleer loblar aracılığıyla tanımlanabilen ve temel hücreleri nötrofiller olan epitel hücreleri ve infiltre lökositler incelenir. İnoküle edilmemiş farelerde, eğer tespit edilirse, çok az sayıda nötrofil saptanır. Bu şekil, vajinal fungal yüküne bir örnek göstermektedir.

Vajinal lavaj sıvısı belirli zaman noktalarında toplanır ve CFU sayımı için kültüre edilir. Bu örnekte sıvı, inokülasyondan sonraki beşinci günde toplanmış, seri dilüsyonla plaklara ekilmiş ve 48 saat boyunca inkübe edilmiştir. Ardından koloniler sayılır ve vajinal fungal yük hesaplanır; östrojen uygulanmış inoküle farelerde candida ile vajinal kolonizasyon veya enfeksiyon haftalarca sürer.

Östrojen tedavisi uygulanmamış inoküle edilen farelerde candida vajinal kolonizasyon oluşturamazken, östrojen tedavisi uygulanmış inoküle edilmemiş fareler süre boyunca candida açısından negatif kalır. Ayrıca, vajinal lavajlar ya her zaman noktasında farklı farelere bir kez ya da aynı farelerde anestezi altında boylamsal olarak gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, vajinaya travma verilmesini önlemek için hayvanların güvenli bir şekilde sabitlendiğinden emin olmak önemlidir ve vajinal dokular çıkarılırken doğru vajinal fungal yükü elde etmek için lavajın titizlikle yapılmasına gerekli zaman ayrılmalıdır.

Dehidrasyonu önlemek için durgun PBS kullanın; lenf düğümlerini çıkarırken ve lenf düğümü hücrelerini işlerken ana ven ve arterlere zarar vermemeye dikkat edin, hücre canlılığını korumak için hücreleri buz üzerinde veya dört derecede tutun. Bu videoyu izledikten sonra, vajinal fungal yükü tekrarlanabilir şekilde nicelendirmek ve spesifik immünolojik veya histolojik analizler için vajinal veya lenfoid dokuları çıkarmak amacıyla candida vajiniti deneysel fare modelinin nasıl uygulanacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.