Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster

Bu prosedürün genel amacı, drosophila melan gastro metamorfik gelişimi sırasında aktif olan CIS düzenleyici elementlerin veya CRE'lerin gen düzenleyici aktivitelerini nicel olarak ölçmektir. Reporter transgenler olarak transgenik olarak yerleştirilmiş CRE hatları oluşturmak için bölgeye özgü entegrasyon yöntemleriyle başlayın. Bir stereo mikroskop kullanarak, doğru gelişim evresindeki transgenik örnekleri elde edin.

Örnekleri dıştaki tüpten çıkarın ve cam mikroskop lamına monte edin. Tüm montajlı örneklerdeki floresan raporlayıcı protein ekspresyonunun düzeyini ve örüntüsünü konfokal mikroskopik analiz ile kaydetmek için işleme devam edin. Son olarak, kaydedilen konfokal görüntüler için floresan raporlayıcı protein ekspresyon düzeyini Image J yazılım aracı kullanarak nicelendirin.

Bu sonuçlar, düzenleyici elementlerin belirlenmesine yardımcı olmak ve modifiye edilmiş CRE versiyonları üzerinde daha ileri karşılaştırmalı gen ekspresyon çalışmaları yürütmeyi kolaylaştırmak amacıyla bir gen düzenleyici aktivite seviyesi atar. Bu prosedür, gen düzenlemesi ve bu gen düzenlemesinin nasıl kodlandığıyla ilgilenenler için temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. DNA, gelişimsel ve evrimsel biyolojinin temelini oluşturur.

Bu prosedür, drosophila melanogaster metamorfik gelişimi sırasında işlev gören cis düzenleyici elementler hakkında bilgi sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Ancak prensip olarak, diğer gelişim aşamaları ve diğer meyve sineği türleri, hatta diğer model organizmalar sırasında işlev gören cis düzenleyici elementlere de uygulanabilir. Transgenik hatları genişletmek için, dönüşümlü günlerde birkaç erkek ve dişi sineğin bulunduğu iki şişe hazırlayın.

Sinekleri flakonlardan birinden yeni bir flakona aktarın. Bu işlemi bir hafta boyunca tekrarlayın. İki haftanın sonunda, transgenik meyve sineklerinin larva aşamasından ergin gelişim aşamalarına kadar farklı evrelerde olduğunu doğrulayın.

ER oluştuğunda, üçüncü instar larva evresinin sonunda örneklerin evrelemesine başlayın. Örneği hareket etmez durumda not edin. ER yumuşak beyaz renktedir ve küreler yön değiştirmiştir; bu zaman noktasını belirtin.

0 HAPF'de. Metamorfozun uzunluğuna dayalı evreleme yapmak için, vücudun orta noktası yakınında şeffaf daireler şeklinde görünen bilateral yerleşimli gonadların varlığıyla erkekleri dişilerden ayırt edin. 0 HAPF'de, nemlendirilmiş bir resim fırçası kullanarak örnekleri taze bir şişeye aktarın.

Numunelerin kurumasını önlemek için bir parça Kim wipe ekleyin ve suyla nemlendirin. Ardından, istenen HAPF değerine ulaşılana kadar flakonu 25 °C'de inkübe edin. Alternatif olarak, ek metinde ayrıntıları verildiği üzere, çeşitli morfolojik belirteçlerin varlığına ve konumuna göre tanımlama yaparak numuneleri evreleyin.

Laboratuvar bandı kullanarak, yapışkan yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir parça paketleme bandını bir diseksiyon tahtasına yapıştırın. Bir boya fırçasını ıslatın ve boya fırçası kullanarak örnekleri nemlendirin. Örnekleri bir Kim wipe'a aktarın.

Örnekleri paketleme bandına aktarın ve dorsal yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yapıştırın. Örneklerin 15 dakika boyunca kurumasına izin verin. Pens yardımıyla ER'yi kademeli olarak açın.

Anterior veya perm kısmından başlayarak posterior uca doğru ilerleyin. Ardından, tüm mount örnekler için, püiyi bir mikroskop lamı üzerindeki vizkoz bir yağ damlasına aktarın ve örneği mikroskobik olarak değerlendirin. Örneği odaklamak için ya Forex ya da 10 x objektif kullanın.

Konfokal mikroskop yazılımını kullanarak, fotobeyazlamayı önlemek için istenen floresan proteinin eksitasyon dalga boyunu ayarlayın. %5 ile 10 arasında bir lazer şiddeti ile başlayın. Sinyal yetersizse, sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için şiddeti gerektiği kadar artırın. Konfokal görüntüler için, CRE aktivitesinin kantitatif karşılaştırmaları için floresansın en yoğun göründüğü C-kesiti gibi tekrarlanan taramalardan gelen piksel ölçümlerini ortalayan kalman ortalaması gibi yazılım ayarlarını etkinleştirin.

Doygunluk uyarı bakma tablosuna geçin ve kanal voltaj kazancı ile ofseti, çok az pikselin doygunluğa ulaştığı ayarlara getirin. Gerekirse konfokal açıklığı ayarlayın. Optimal ayarlar belirlendikten sonra, Z ekseni boyunca bir dizi görüntü elde etmek için ZS taramasını gerçekleştirin.

Tarama tamamlandığında, görüntü yığınını bir projeksiyona dönüştürün ve bu görüntü dosyasını TIF formatında kaydedin. CRE aktivitelerinin nicel karşılaştırması için, tüm tekrarlı örnekler ve raporlayıcı transgen hatları için aynı konfokal ayarları kullanın. Image J programı başlatılmış durumdayken, değerlendirilecek bir TIFF görüntüsü açarak deneye başlayın.

Serbest seçim düğmesine tıklayın ve örneğin nicelleme yapılmak istenen alanının etrafını çizin. Piksel değeri istatistiğini elde etmek için analiz sekmesine tıklayın ve ardından ölçümü seçin. Sonuçlar kutusundaki ortalama piksel değer puanını kaydedin.

Ayrıca, CRE'nin aktif olmadığı bir arka plan bölgesinden ikinci bir ortalama piksel değeri toplayın. Düzeltilmiş ortalama piksel değerini türetmek için replika örnekler için piksel değeri istatistikleri üretmeye devam edin. Ardından, replika düzeltilmiş ortalama piksel değerlerinden, A CRE için ortalama düzenleyici aktiviteyi belirleyin ve ortalamanın standart hatasını hesaplayın.

Bu deney, transgenik hatları homozigot hale getirmek için beyaz kurtarma göz fenotipinin yoğunluğunu kullanır. Bölgeye özgü transgen entegrasyonu için A TTP iniş bölgesi dizisine sahip bir beyaz gen mutant genetik arka planı kullanılır. Entegre vektör için hemizigot ve homozigot olan transgenik bireyler, entegre edilen mini beyaz genin kopya sayısına bağlı olarak, kurtarılan göz rengi fenotipinin yoğunluğu ile ayırt edilir.

Ardından, en koyu göz rengi fenotipine sahip erkek ve dişi sinekler çaprazlanarak homozigot hatlar oluşturulur. Drosophila'nın larva evresinden yetişkin meyve sineği evresine geçişi sırasındaki metamorfoz aşamasını belirlemek için morfolojik belirteçler kullanılır. Örnek, cinsiyeti belirlemek ve gelişim aşamasını tahmin etmek için kullanılabilecek bir dizi stereotipik morfolojiden geçer.Burada.

Dimorfik element olarak adlandırılan bir CRE'nin vahşi tip versiyonu, dişi puy'ların ASIC abdominal segmentinde yüksek düzeylerde EGFP raporlayıcı ekspresyonunu yönlendirmektedir. Bu CRE içindeki 13 baz çiftlik bir dizinin DSX transkripsiyon faktörü için bir bağlanma bölgesi olduğu saptanmış ve bu dizinin in vivo önemi, söz konusu bağlanma bölgesi mutasyona uğratıldığında CRE'nin düzenleyici aktivitesinin kantifiye edilmesiyle gösterilmiştir. Kantitatif analizler, burada kullanılan transgen insersiyon bölgesi bağlamında, bu DSX bölgesinin mutasyonunun düzenleyici aktiviteyi vahşi tip ekspresyonun %28 ± 3 seviyesine düşürdüğünü göstermektedir.

Benzer karşılaştırmalar, tür içi CRE alelleri veya farklı türlerden alınan otolog CRE'ler için düzenleyici aktiviteleri değerlendirir; örneğin, dişi segmentindeki EGFP seviyeleri ile karşılaştırma yapılabilir. D Melin gastric Canin S suşu tarafından yönlendirilen altı adet, D stimulants ve D willi türleri için otolog CRE'lerin düzenleyici aktiviteleri sırasıyla %75 ± 4 ve %0 ± 0'dır. Bu transkripsiyon faktörü genlerinin CYS düzenleyici elementlerle nasıl etkileşime girdiğine dair ek soruları yanıtlamak için, RNA interferans gibi prosedürel yöntemler transkripsiyon faktörü genleri ile birlikte kullanılabilir.

Bu durum, geliştirilmesinin ardından CIS düzenleyici elementler tarafından yönlendirilen floresan raporlayıcı protein ekspresyonundaki artış ve azalışla belirlenecektir. Bu prosedür, gen düzenleme alanındaki araştırmacıların, cis düzenleyici element motiflerinin ve evrimleşmiş mutasyonların gen ekspresyonu üzerindeki fonksiyonel önemini keşfetmelerine olanak sağlamıştır.