Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Bu videoda, kinaz ve fosfataz aktiviteleri hücre döngüsü boyunca Förster Rezonans Enerji Transferi veya FRET kullanılarak izlenmektedir. Burada, bir polo benzeri kinaz 1 veya PLK1 aktivite probunun bir ucuna siyan floresan protein CFP, diğer ucuna ise sarı floresan protein YFP yerleştirilmiştir. Bu prob, U2 OS hücrelerine transfekte edilir.

Ardından, G2/M geçişi sırasında LKK1 hedeflerinin fosforilasyon durumunu incelemek için, TRANSFEKTE edilmiş U2 OS hücrelerine zaman ayarlı floresan görüntüleme uygulanır. CFP ve YFP birbirine yakın olduğunda ve CFP uyarıldığında, enerji YFP'ye aktarılır ve YFP emisyonu tespit edilebilir. Ancak, prob fosforile olduğunda, proteindeki konformasyonel bir değişiklik CFP ve YFP'yi birbirinden ayırır.

Şu anda CFP uyarıldığında, güçlü bir CFP emisyonu ve yalnızca zayıf bir YFP emisyonu tespit edilir; hem CFP hem de YFP uyarımı sonrası YFP emisyonu oranının kantifikasyonu, PLK1 aktivitesinin G2 evresinde arttığını ve mitoz sırasında zirveye ulaştığını göstermektedir. Dolayısıyla bu tekniğin, standart geometrik görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre döngüsünün ne görüntüleme koşulları ne de bir probun ekspresyonu tarafından bozulmamasına özel bir dikkat gösterilmesidir. Bu yöntem, hücre döngüsü alanındaki spesifik kinazların veya fosfatazların nerede ve ne zaman aktive olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem hücre döngüsü tarafından düzenlenen enzimler hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre proliferasyon analizleri gibi stres koşullarının gerekliliği olan diğer sistemlere de uygulanabilir. İnsan hücre döngüsünü izlemek için U2 OS hücreleri, FRET tabanlı bir PK1 aktivite probu ile transfekte edilir. Standart kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullanılarak, hücreler en az yedi gün boyunca purmisin ile seçilir.

Bu işlem, probu eksprese eden hücre popülasyonunu zenginleştirir ve toksik ekspresyon seviyelerine veya hücre döngüsünü ciddi şekilde etkileyen ekspresyon seviyelerine sahip hücre sayısını sınırlar. Ardından, sınırlı dilüsyon yöntemiyle stabil klonlar seçilir ve CFP ile YFP ekspresyonu, tüm hücrelerde yaklaşık olarak aynı oranda bulunduklarını doğrulamak için incelenir. Bazı hücreler yalnızca CFP veya YFP içeriyorsa, bu durumda muhtemelen rekombinasyon meydana gelmiştir; bu durumda plazmit hazırlama işlemini sure two hücreleri gibi homolog rekombinasyona daha az yatkın bakteriler kullanarak tekrarlayın, ardından plazmidi lineerize edin ve transfeksiyona yeniden başlayın.

Hücreler probu stabil bir şekilde eksprese ettiğinde, tutunmalarını takiben ve %30 ila %50 konfluens düzeyine ulaştıklarında, onları 1,5 numaralı cam tabanlı kaplara ekleyin. Besiyerini, CO2'den bağımsız ve fenol kırmızısı içermeyen bir besiyeri ile değiştirin ve hücreleri, sıcaklık kontrolü 37 °C'ye ayarlanmış motorlu bir epi-floresans mikroskoba yerleştirin. Mikroskop, CFP ve YFP eksitasyon ve emisyon filtreleriyle donatılmış olmalıdır.

CFP ve YFP izleme için uygun bir ROIC aynası ve gereken çözünürlük için uygun bir objektif. Burada, 20 x NA 0.75 hava objektifi kullanılmıştır. Geçirgen ışık kullanarak hücreleri odaklayın.

Hücre döngüsünü bozabilecek bir stres yanıtına yol açacağı için bu aşamada floresan ışık kullanmayın. Fototoksisiteyi önlemek için, gerekli hücre altı çözünürlüğe izin veren mümkün olan maksimum bükülme ayarını seçin. Bu deney için çekirdek ve sitoplazmanın ayırt edilebilmesi gerekir.

Kısa bir pozlama süresi ayarlayın ve yüksek nötr yoğunluk filtresi yerleştirin. Ardından, YFP eksitasyon ve emisyonunu kullanarak 12 veya 16 bitlik bir test görüntüsü edinin; bir hücredeki ortalama yoğunluk, yaklaşık olarak arka plan yoğunluğu artı minimum ve maksimum arka plan yoğunlukları arasındaki farkın beş katına eşit olacak şekilde pozlama süresini ve nötr yoğunluk filtrelerini ayarlayın. Görüntülerin doygunluğa ulaşmadığını doğrulamak için örnek görüntünün floresan yoğunluğunu inceleyin.

Hücreler mitoza girdiğinde oluşacak yoğunluk farklılıklarına olanak tanımak için görüntüdeki maksimum yoğunluk, dinamik aralığın yarısından az olmalıdır. Ardından, bu işlemi CFP eksitasyon ve YFP emisyon filtrelerini kullanarak tekrarlayın. Odaklama ve pozlama koşullarının optimizasyonu için kullanılan bölgeler hariç, transfekte hücrelerin bulunduğu birden fazla bölge seçin.

Bu prosedürler bir stres yanıtını tetiklemiş olabileceğinden, tüm hücrelerde maksimum yoğunluğun dinamik aralığın yarısından az olduğundan emin olun. Yazılımı; YFP eksitasyonu, YFP emisyonu ve CFP eksitasyonu ile YFP emisyon filtrelerini kullanarak her 45 dakikada bir iki görüntü alacak şekilde ayarlayın.

Ayrıca, deneyin toplam süresini hücre döngüsünün süresini aşacak şekilde ayarlayın. Tüm ayarlar tamamlandıktan sonra görüntüleme işlemine başlayın; görüntüleme tamamlandığında, elde edilen görüntüleri açın ve mitozdan mitoza kadar olan hücre döngüsü süresini izleyin. Burada transfekte probu eksprese eden hücreler için hücre döngüsü süresi yaklaşık 20 ila 25 saatti.

Bunu, kullanılan hücre tipi için kontrol verileriyle karşılaştırın. Hücre döngüsü süresi referans zamanlamalarla uyumluysa fret analiz edilebilir. Zamanlama doğrulandıktan sonra görüntüler analiz edilebilir.

Analiz, mikroskopiye yönelik çoğu yazılım ile gerçekleştirilebilir. Burada, Image J ücretsiz yazılımı ratio plus eklentisi ile birlikte kullanılmıştır. Analize, görüntüleri Image J'de açarak başlayın. Görüntüler çok renkli yığın (stack) formatındaysa, "image" sekmesi üzerinden görüntüleri bir hiper yığına (hyper stack) dönüştürerek tekil kanalları ayırın.

Ardından hyper stack ve sonrasında stack to hyper stack işlemini uygulayın. Görüntülenen ayarlarla birlikte convert to hyper stack penceresi açıldığında tamam'a tıklayın. Görüntü artık altında iki adet kaydırıcı çubukla birlikte görüntülenecektir.

Görüntüleri tek kanallı yığınlara ayırmak için görüntüye tıklayın ve "hyperstack reduce dimensionality" seçeneğini belirleyin. Bu işlem "reduce" penceresini açacaktır; "frames" ve "keep source" seçeneklerinin seçili olduğundan emin olun. Ardından "Okay" butonuna tıklayın.

Yalnızca tek bir kanal içeren yeni bir görüntü belirecektir. İkinci kanalın olduğu yeni bir görüntüyü açmak için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, nihai görüntülerin görsel netliğini artırmak için YFP eksitasyon YFP emisyon yığınını seçin.

İşlem (process) sekmesine, ardından matematik (math) sekmesine tıklayın. Sonra çarpma (multiply) seçeneğine tıklayın. Çarpma penceresi açıldığında, YFP eksitasyon YFP emisyon yığınını üçle çarpmak için üç değerini girin. Bu adım isteğe bağlıdır ve oranların sıfır ile bir arasındaki değerlerde olmamasını sağlar.

Ardından, Image J araç çubuğunda serbest çizim (freehand) aracını seçin. Sonra YFP eksitasyon, YFP emisyon yığınında, hücre içermeyen ancak ölçümü yapılacak bir hücreye yakın bir bölgeye bir ilgi alanı veya ROI çizin; ROI'yi ROI yöneticisine eklemek için analiz araçlarına (analyze tools), ardından ROI yöneticisine (ROI manager) tıklayın.

ROI yönetici penceresi görünecektir. YFP eksitasyon YFP emisyon yığınındaki ROI'nin ortalama yoğunluğunu ölçmek için ROI koordinatlarını kaydetmek üzere ekle seçeneğine tıklayın. Analiz seçeneğine tıklayın, ardından ölç seçeneğini belirleyin.

Sonuçlar penceresi açılacaktır. CFP eksitasyon YFP emisyon yığınını seçin. Ardından ROI yöneticisindeki ROI'ye çift tıklayın ve ölçümü tekrarlayın.

Ölçüm, sonuçlar penceresine eklenir. Bu işlemi birden fazla zaman noktasında tekrarlamak için yığındaki diğer konumlara kaydırın. Sonuçlar penceresindeki ölçümleri karşılaştırarak, ilgi duyulan hücreye yakın arka plan yoğunluklarının film boyunca benzer olduğunu doğrulayın.

Ölçümleri minimum yoğunluğu içerecek şekilde ayarlamak için analyze'e tıklayın, ardından set measurements'a tıklayıp minimum ve maksimum gri değerini belirtin. Ardından ölçüm alternatiflerini gösteren bir pencere açılacaktır. Gerektiğinde parlaklık ve kontrast ayarlarını yaptıktan sonra, bir hücrenin büyük kısmını kapsayan bir ROI çizin ve her iki yığında da minimum yoğunluğu ölçün.

Ardından, bu kez arka plan yerine bir hücre kullanarak önceki gibi ölçümler yapın. Sonuçlar bölümlerindeki değerleri kullanarak, ölçülen minimum yoğunluk ile arka plan yoğunluğu arasındaki farkı hesaplayın ve bu değeri ikiye bölün. Bu işlem, clipping value to open ratio artı seçili eklentiler için başlangıç tahmini bir değer sağlar.

Ardından ratio plus'ı seçin. FRET oranı için, CFP uyarımı YFP emisyonu S yığını 1'i veya fosforilasyon üzerine FRET verimliliğinin azaldığı probları görselleştirmek için ters FRET oranını seçin. Ölçülen arka plan yoğunluklarını ve kırpma değerlerini eklemek için YFP uyarımı YFP emisyonu S yığını 1'i seçin.

Sonuç penceresindeki değerleri kullanın ve bunları oran artı penceresine yapıştırın. Elde edilen oran yığınının ölçeklendirmesini ayarlayın ve oran değişimlerini görselleştirmek için uygun bir görünüm tablosu uygulayın. PLK1 aktivitesini izleyen fret tabanlı bir prob eksprese eden U2 OS hücreleri, bu videoda açıklandığı şekilde 60 saat boyunca filme alınmıştır.

Bu görüntü, yavru hücrelerin bölünmeleri de dahil olmak üzere, fret probu eksprese eden 50 hücrenin kümülatif mitotik girişini göstermektedir. Probu eksprese eden hücrelerin çoğunluğu 20 ile 25 saat arasında bir hücre döngüsü süresiyle çoğalmaktadır; bu durum, görüntüleme koşullarının ve probun ekspresyon seviyelerinin hücre döngüsü zamanlamasını etkilemediğini göstermektedir. Bir hücrenin dört bölünme boyunca takibini yapan ters çevrilmiş fret oranının yalancı renkli temsili, önemli miktarda gürültü olmasına rağmen, PK one aktivitesinin G two evresinde arttığı ve mitoz sırasında zirveye ulaştığı bir eğilimin görüldüğünü kanıtlamaktadır.

Ham veriler ortalama filtrelendiğinde ve bir grafik olarak sunulduğunda, aktivite pikleri arasındaki süreyi tahmin etmek kolaylaşır. Bu şekil, önceki görüntülerde gösterilen hücrenin ters FRET oranının grafikten elde edilen nicelleştirmesini göstermektedir. Aktivasyon zamanlaması tahmin edilebilir ve burada görülebileceği gibi, probun fosforilasyonu, fosforilasyonun mitozda zirve yapmasından yaklaşık dört saat önce görünür hale gelmektedir.

Bu prosedür uygulanırken, hücrelerin stres koşullarına maruz kalmamasını sağlamak önemlidir; bu nedenle ışığa maruziyet minimuma indirilmeli, ayrıca sıcaklık veya pH değişimleri en aza indirilmelidir. Ayrıca, bu yöntemin bir hücredeki kinaz ve fosfataz aktivitesi arasındaki dengeyi izlediğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedür, söz konusu kinazların ve fosfatazların yukarı akış regülatörlerini belirlemek amacıyla RNA interferansı veya inhibitör taramaları ile birleştirilebilir.