İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Bu prosedür, oligo DDR glial hücre ölümünün gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Bu işlem, önce hücrelerin kültüre edilmesi, ardından hücrelerin canlı hücre görüntüleme için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hücrelere bir uygulama yapmak ve etkileri floresan mikroskobu kullanarak izlemektir.

Son adım veri analizini gerçekleştirmektir. Nihayetinde sonuçlar, kaspaz ile aktive olan bir floresan boyanın nükleer floresansı izlenerek, bir tedavi veya stimülasyon sonrası hücre popülasyonundaki hücre ölümü oranlarını gösterir. Bu tekniğin immün boyama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, birden fazla zaman noktasından eş zamanlı olarak veri toplama yeteneğidir.

Bu yöntem, farmakolojik yanıtlara, reaktiflere ve çeşitli tedavilere verilen tepkiler gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, bu yöntem hücre kültürlerindeki ölüm süreçleri hakkında bilgi sağlayabilir. Beyin kesitleri dahil olmak üzere ex vivo ve organotipik dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, fikse edilmiş doku yerine canlı doku ile çalışmaya alışırken zorluk yaşayabilirler. Fikse edilmiş dokuya kıyasla canlı hücre örneklerini hazırlamak için çok sayıda adım olduğundan, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. İlk olarak, dondurulmuş ölümsüzleştirilmiş N 19 oligo droog glial hücreleri 37 °C su banyosunda çözdürün.

%10 FBS ve %1 % penisilin streptomisin ile desteklenmiş yedi mililitre yüksek glukozlu DMEM'i 10 santimetrelik bir kültür kabına ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu plağa damla damla ekleyin ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için Petri kabını nazikçe çalkalayın. Hücreleri %5 karbondioksit inkübatöründe 34 derece Celsius'de dört saat boyunca kültüre edin.

Kalan DMSO'yu uzaklaştırmak için plaklardaki besiyerini aspire edin. Dört ila yedi günlük büyümeden sonra bunu yedi mililitre taze besiyeri ile değiştirin. Hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında besiyerini aspire edin ve hücre tabakasının üzerine bir mililitre damlatarak pipetle ekleyin, ardından beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Ardından hücreleri hasat edin; hasat edilen hücreleri 0,1 × 10⁶ hücre/mL yoğunlukta 10 cm'lik bir doku kültürü tabağına ekleyin ve bu tabağı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir pasaj daha geçtikten sonra, hücreler canlı hücre görüntüleme deneyleri için plakalanabilir. Bunun için, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin, ardından hücre süspansiyonundan 30 µL alın ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.

Ardından, kaplanmamış cam lamel yerleştirmek için steril pens kullanın. Altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara, mililitre başına 0,1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda hücre ekleyin. Transfeksiyondan önce, %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 2 mL fenol içermeyen DMEM yüksek glukoz besiyerinde hücrelerin 34 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca büyümesine izin verin.

Ertesi gün, 100 µL serumsuz ortam, 0,5 ila 4 µg saflaştırılmış plazmid DNA ve 4 µL FUgene HD'yi birleştirin. Karışımı hafifçe iki kez vorteksleyin ve ardından DNA'nın oda sıcaklığında beş dakika boyunca kompleks oluşturmasını sağlayın. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, FUgene HD DNA karışımını doğrudan kültürlenmiş hücrelere ekleyin.

Karıştırmak için plakayı hafifçe eğin. Ardından, uygulama veya deney öncesinde hücreleri 34 °C ve %5 karbondioksit ortamında 48 saat daha kültüre edin. İlk olarak, LCI Cham ışık canlı hücre cihazı kontrol kutusunu açın.

Sahnenin tamamen ısındığından emin olmak için bu işlem, deney başlamadan üç saat önce yapılmalıdır. Kontrol kutusu, en azından deneye başlamadan bir saat önce açılmalıdır. Ardından, bir laminar akış kabininde çalışarak, LCI Cham ışıklı manyetik tip kültür odasına ve penslere %70 ethanol püskürtün ve beş dakika boyunca kurumalarını bekleyin.

Hücreleri inkübatörden çıkarın ve sağlıklı olduklarını onaylamak için mikroskop altında inceleyin. Hücreler, cam lam üzerinde çok sayıda membran çıkıntısına sahip, canlı ve iyi yayılmış görünmelidir. Çıkıntı sayısı azalmış veya çekirdeği düzensiz şekilli olan hücrelerin, transfeksiyondan dolayı stres altında olması muhtemeldir ve laminar akışlı kabinde yürütülecek ileri deneyler için uygun değildirler.

Altı kuyucuklu plakayı eğin ve lamelini pensle çıkarın. Lameli, hücreli yüzeyi yukarı bakacak şekilde hızlıca haznenin alt plakasına yerleştirin. Lamelin kurumasına izin vermeyin.

Ardından, kültür odasının manyetik ana gövdesini takın ve orijinal altı kuyucuklu plakadan 500 µL besiyerini lamelin üzerine ekleyin. Besiyerinin yeniden kullanılması, çevresel değişikliklerin hücreler üzerinde oluşturduğu stres miktarını azaltır ve hücre dışı salgılanan faktörlerin değerlendirilmesi için de faydalı olabilir. Besiyeri eklendikten sonra, cam kapağı kültür odasının üzerine yerleştirin ve %70'lik alkol emdirilmiş bir Kim wipe ile lamelin alt kısmında mikroskobiyi engelleyebilecek tüm kalıntıları temizleyin.

Kültür haznesini 34 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde 30 dakika bekletin. Bu adım, lamelin kaymasını azaltmak için haznenin kendisinin 34 °C'ye ısınmasını sağlayacaktır. Metal ısınırken, sonraki adımlar boyunca ortam oda aydınlatmasının mümkün olduğunca düşük tutulması gereklidir.

İlk olarak, Thora daha önceden oda sıcaklığında nuke view elequa hazırlamıştır. Ardından kültür odacığını inkübatörden çıkarın ve hızla mikroskobun çevre odacığına yerleştirin. Çift regülatörlü %5 önceden karıştırılmış karbondioksit tankını açın.

Ardından, mikroskop lambası yaklaşık 2.5 volt ve pozlama süresi 240 milisaniye olarak ayarlanmışken 10x objektifi kullanın. Hücreleri bilgisayar ekranında görüntülemek için parlak alan mikroskobisi ile odaklama yapın. Daha sonra, bir peristaltik pompa kullanarak yavaş ve lokal perfüzyonla ortam değişimi yoluyla hücrelere 80 millimolar konsantrasyonda potasyum iyonu veya diğer apoptoz indükleyiciyi ekleyin.

nuke view 4 88 substratı, 36 saate kadar süren deneyler için hücre kültüründe stabildir. Bu nedenle, deneylerin bu süre zarfında yürütülmesi mümkündür. İlk olarak, kırmızı ve yeşil floresan proteinlerden gelen floresansı görüntülemek için mikroskobu ayarlayın.

Ardından, transfekte edilen hücreleri görüntülemek için kırmızı kanala tıklayın. Birkaç transfekte hücrenin bulunduğu yaklaşık 12 kare seçip kaydedin ve bu XY sahne noktalarını saklayın. Mikroskobun, kaydedilen bu sahne noktalarında her altı dakikada bir brightfield, kırmızı kanal ve yeşil kanalda görüntüler yakalamasını sağlayın.

Tekrarlanan veya üçlü deneylerden birden fazla XY noktası topladıktan sonra, farklı günlerde gerçekleştirilen ayrı deneylerden elde edilen verileri derleyin ve CASP bay negatif hücrelerin CASP bay pozitif hücrelere oranını karşılaştırmak için yazılı protokolde açıklandığı şekilde veri analizi ve istatistiksel testleri gerçekleştirin. Nuke view 4 88 substratı, N 19 oligo DDR glial hücre kültürlerinin apoptoz hızındaki artışı gösterebilir. Yüksek hücre dışı potasyum konsantrasyonu ile yapılan bir tedavinin ardından, bu bazal görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edilmiştir.

N 19 hücreleri RFP ile transfekte edilmiş ve kontrol hücreleri için üç microliters nuke view, 4 88 substratı ile veya üç microliters nuke view, 4 88 substratı ve 80 millimolar potasyum ile işleme tabi tutulmuştur. Bu görüntüler, apoptotik hücre sayısının zamanla arttığını göstermektedir; 80 millimolar potasyum uygulaması sonrası üç, altı ve dokuzuncu saatlerde, kontrol koşullarına kıyasla 80 millimolar potasyumla işlenmiş kültürlerde anlamlı miktarlarda apoptoz gözlemlenmemiştir. Kontrol koşullarında gözlenen arka plan yeşil sinyali, ekstraselüler potasyum eklenmeden apoptoza giren hücreleri göstermektedir.

Nörolojik hasarları içeren çalışmalar için 12 saatlik bir zaman seyri yeterlidir. 12 saatin sonunda, potasyum ile işleme tabi tutulan kültürlerde yaklaşık %45 hücre ölümü gözlemlenmiştir. Kontrol deneyindeki hücrelerin neredeyse hiçbirinde 12. saat zaman noktasında apoptoz görülmemiştir. Bununla birlikte, diğer durumlarda deneylerin daha uzun süre devam ettirilmesi gerekebilir.

Bu grafik, 12 saatlik deney süreci boyunca kaspaz üç pozitif hücrelerdeki artışı göstermektedir. Optimize edildiğinde, bu teknik bir saat içinde tamamlanabilir ve uygun şekilde uygulandığında veriler gece boyunca toplanabilir. Bu prosedür uygulanırken, işlemler arasında tutarlı olunması gerektiğini unutmamak önemlidir.

İncelenen yolaklarda yer alan diğer aşağı akış proteinlerini gözlemlemek için immün boyama gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntüleme için örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir veri seti edinin ve verilerinizi analiz edin.