2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Bu prosedürün genel amacı, uygulanan elektrik alanlarının 2D kültür ve 3D ex vivo modellerindeki nöral progenitör hücre migrasyonu üzerindeki etkisini kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle nöral progenitör hücrelerin in vitro ortamda izole edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise nöral progenitör hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlamaktır.

Ardından, 2D kültür hazırlığı için nöral progenitör hücreler özel tasarlanmış elektrot odacıklarına ekilir. Alternatif olarak, 3D ex vivo model hazırlığı için nöral progenitör hücreler hooks 3, 3, 3, 4, 2 ile işaretlenir ve bir omurilik kesiti organotipik modeline enjekte edilir. Son olarak, elektrot odacıklarına bir elektrik alanı uygulanır ve progenitör hücrelerin hem 2D hem de 3D ortamlarda elektrik alanının katoduna doğru göç ettiğini göstermek için zaman ayarlı (time-lapse) kayıt yapılır.

Bu tekniğin temel avantajı, doğal ortamı yakından taklit eden 3D organotipik bir modele transplantasyon sonrası tekil hücrelerin elektrik alanı ile indüklenen migrasyonunun canlı olarak izlenmesi için yeni bir yöntem sunmasıdır. Bu yöntem, spinal kord kesitine transplant edilen nöral kök hücrelerin migrasyonu ve elektro teknik hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, küçük beyin kesit modelleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, otoklavlanmış 22 by 22 milimetrelik camları bölerek 22 by 11 milimetrelik cam şeritler hazırlayın.

Bir elmas kalem kullanarak 1 numara kalınlıktaki lamel kapakları ikiye bölün. Ardından, 22 x 11 mm boyutundaki dört şeridi yüksek vakum silikon gresi ile dikey olarak birbirine yapıştırarak, iç boyutları 22 x 10 mm olan bağımsız bir cam kuyucuk oluşturun; kuyucuğun gece boyunca tamamen kuruması ve sertleşmesi için bekleyin. Ertesi gün, 2 adet 22 x 11 mm boyutundaki cam şeridi, aralarında 10 mm boşluk kalacak şekilde silikon gresi kullanarak 100 mm'lik bir kültür kabının tabanına birbirine paralel olarak sabitleyin.

Ardından, 22 by 22 milimetre boyutunda bir lamelini silikon gres ile yapıştırarak bu şeritler arasındaki bölgeyi mühürleyin. Cam kuyucuğu, iç duvarlar hücre ekimi için sınırlı bir alan oluşturacak şekilde lamellerin üzerine yerleştirin. Tüm eklem yerlerini silikon gres ile su geçirmez hale getirin.

Bu kısıtlı bölgeyi, beraberindeki makalede açıklandığı gibi sırasıyla polidekilsin ve ardından laminin ile kaplayın. Bu prosedürde, E 14 ile E 16 farelerden beyinleri alın ve soğuk D-M-E-M-F 12 bazal besiyerine yerleştirin. Ardından, meningesleri anatomik mikroskop altında uzaklaştırın.

Ardından, beyinleri 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Beyinleri doku fragmanlarına ayırmak için ince pens kullanın. Daha sonra bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

D kalıntılarını uzaklaştırmak için örnekler üç dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjlenir. Ardından, BFDF ve DGF içeren A-D-M-E-M-F 12 örneklere eklenir. Bir mililitrelik pipet ile titrasyon yapılır.

Ardından, hücre süzgeci kullanarak tek hücre süspansiyonunu elde edin. Hücreleri, mililitre başına 20, 000 ile 50, 000 hücre olacak şekilde flasklara ekin. Daha sonra, hücrelerin beş dakika boyunca 1, 300 RPM'de santrifüj edilmesini içeren tam bir besiyeri değişimini her üç günde bir gerçekleştirin.

Süpernatan çökelek atılır, PT taze besiyerine askıya alınır ve hücreler en az beş gün sonra her altı günde bir flaska geri aktarılır. NEUROSFERLER 15 mililitrelik bir tüpe aktarılarak 1.500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Süpernatan atılır.

Tek hücre süspansiyonu elde etmek için peleti tripsin EDTA içinde yeniden süspande edin. Hücre sayımı yapmadan önce, 10.000 hücre içeren bir mililitre süspansiyon hazırlayın. Ardından, laminini cam kuyucuktan uzaklaştırın ve tamamen kurumasına izin verin.

Bunu bir mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. Ardından, yapışmanın gerçekleşmesi için plakı 37 °C'deki inkübatöre en az dört saat boyunca yerleştirin. Hücreler yeterince konfluen hale geldiğinde, ortamı bölmeden uzaklaştırın.

Camı dikkatlice çıkarın. Ardından, 22 x 22 mm'lik bir otoklavlı cam lamelleleciyi, silikon gres kullanarak 2 adet 22 x 11 mm'lik şerit arasına dikkatlice yerleştirerek hücrelerin üzerine bir tavan oluşturun. Kurumayı önlemek için hücrelerin üzerini birkaç damla besiyeri ile kaplamayı unutmayın.

Ardından, kabın bir ucundan diğerine uzanan iki adet su sızdırmaz silikon gres bariyeri oluşturarak odanın her iki ucunda izole bir besiyeri rezervuarı oluşturun. Bir besiyeri rezervuarından diğerine akış olduğundan emin olarak odayı taze besiyeri ile doldurun. Sonrasında, hücrelerin toparlanmasına izin vermek için kabı 12 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Bir sonraki adımda, her biri migrasyon odasının bir rezervuarının üzerine gelecek şekilde iki delik açarak kabı kapatacak bir kapak hazırlayın. Ardından, odadaki besiyerini 25 millimeter hippies buffer içeren kültür besiyeri ile değiştirin. Bundan sonra, kabı sıcaklık kontrollü görüntüleme sistemine aktarın.

Zaman ayarlı (time lapse) ve çok konumlu kayıt için deneysel parametreleri ayarlayın. Elektrik alan vektörünün, mikroskop altında görüldüğü ve görüntüleme sistemine kaydedildiği şekilde yatay olarak ilerlemesini sağlamak için katot ve anot sırasıyla sol ve sağda olacak şekilde hazneyi hizalayın. Ardından, iki beheri doldurun.

Steinberg çözeltisi ile. Önceden hazırlanmış, %2'lik Steinberg agar çözeltisi ile doldurulmuş cam köprüleri kullanarak her bir besiyeri rezervuarına ayrı bir beher bağlayın. Ardından, bir DC güç kaynağına bağlı gümüş elektrotları Steinberg çözeltisine yerleştirin.

Her bir beher için, güç kaynağındaki voltaj kadranını sıfıra getirin ve cihazı açın. Voltaj kadranını artırırken, bir voltmetre ile elektrot odası üzerindeki voltajı ölçün. Ardından, voltajı deneysel gereksinimlere uygun şekilde ayarlayın.

Ardından, zaman atlamalı (time-lapse) kaydı başlatın. Besiyeri değişimi yapın ve voltajı gerektiği şekilde yeniden ayarlayın. Her saat başı, rezervuarlara gerektiği şekilde taze besiyeri, ilaçlar veya kimyasal ajanlar eklenebilir.

Her bir ortam rezervuarının üzerine gelecek şekilde kültür kabı kapağına delinen ek delikler kullanılır. Bu adımda, iki haftalık farelerin lomber omurilikleri diseke edilir. Ardından omurilikler, bir anatomik mikroskop altında Machel-Wane doku doğrayıcı ile 500 micron kalınlığında kesitlere ayrılır.

Kesitleri birbirinden ayırın ve sagittal aksiyel spinal kord yapısı bozulmamış olanları seçin. Ardından, kesitleri 30 µL MA jel içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Kesitleri mümkün olduğunca merkeze yakın konumlandırın.

Bunları %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de en az 30 dakika boyunca tutun. Matrigel proteinlerinin, omurilik kesitlerinin yüzeyini kaplayan ince bir film oluşturacak şekilde kendi kendine organize olması için matrigelin tamamen organize olmuş olması çok önemlidir. Gerekirse Petri kabını 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin, ardından üzerine 25 mM HEPES tamponu ve %15-20 fetal sığır serumu içeren 4-6 mL DMEM-F12 besiyeri ekleyin.

Besiyerinin doğrudan dilimlerin üzerine akmasını önlemek için çok nazikçe, dilimlerin besiyerine tamamen gömülmediğinden ve patlıcanların yüzeyinin havaya iyice maruz kaldığından emin olun. Besiyerini haftada iki kez değiştirin. Şimdi nöral progenitör hücre süspansiyonunu beş micromolar hooks içeren besiyerinde inkübe edin.

30 dakika boyunca 3, 3, 3, 4, 2. Mikroskop altında, bir kapiler cam tüp kullanarak spinal kord kesitine iki µL süspansiyon mikroenjeksiyonu yapın. Kapiler cam tüpün matrigel'den geçtiğinden ve spinal kord kesitinin iç kısımlarına ulaştığından yavaşça emin olun.

Hücre süspansiyonunu önlemek için cam tüpü omurilik kesitinin içinde en az 30 saniye tutun. Ardından, omurilik kesitini içeren Petri kabını 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatöre gece boyunca yerleştirin. Ertesi gün, 500 mV/mm değerinde bir elektrik alanı uygulamadan önce, 3 3 3 4 2 şeklinde etiketlenmiş nörojenez hücrelerini içeren kancalarla omurilik kesitinin etrafına bir elektrot odası kurun.

Burada nöral progenitör hücreler, elektrik alanlarına maruz kaldıklarında katoda doğru oldukça yönlenmiş bir migrasyon göstermektedir; kırmızı çizgiler ve mavi oklar sırasıyla hücre hareketinin yörüngelerini ve yönünü temsil etmektedir. Burada ise gösterilen migrasyon yollarının grafiği yer almaktadır. Burada 3 3, 3, 4 2 kancalarıyla işaretlenmiş nöral progenitör hücreler görülmektedir.

Elektrik alanı uygulamasının başlangıç noktasında, organotipik omurilik kesitine nakledildiler. Nöral progenitör hücreler 2,5 saat boyunca katoda doğru yönlü bir şekilde göç ettikten sonra, elektrik alanının polaritesi tersine çevrildi. Değişen elektrik alanı polaritesi, aksonların yeni katoda doğru keskin bir şekilde geri dönmesini tetikledi.

Burada, omurilik kesiti içerisindeki transplant edilen nöral progenitör hücrelerin bir görüntüsü yer almaktadır. Zaman atlamalı kaydın sonunda, omurilik kesiti içerisindeki transplant edilen nöral progenitör hücrelerin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonu burada gösterilmiştir. Kütle kontrol altına alındı.

Bu teknik, geliştirilmesinin ardından uygun şekilde uygulandığında iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, elektrik alanına yanıt olarak 2D ve 3D kültür sistemlerinde nöral progenitor hücrelerin göçünü incelemelerinin ve uygulamalarının yolunu açmaktadır.