Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

Bu prosedürün genel amacı, fare korteksindeki mikro bölgesel doku hipoksisini in vivo olarak doğrudan görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle anestezi altındaki bir farede açık kafatası kraniyal penceresi hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, serebral kan damarlarını işaretlemek için intravenöz olarak floresan boya enjekte edilir.

Son olarak, intrinsik NADH floresansı ve floresanla işaretlenmiş kortikal mikrovaskülatürün foton görüntülemesi eş zamanlı olarak gerçekleştirilir. Nihayetinde, nikotinamid adenin dinükleotidin indirgenmiş formunun varlığının görselleştirilmesi yoluyla, beyin parankiminin mikro bölgelerinde fonksiyonel hipoksiyi gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin Clark tipi elektrotlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, geniş bir görüş alanı üzerinde yüksek uzamsal çözünürlük sağlaması ve aynı zamanda daha az invaziv olmasıdır.

Bu yöntem, iki floresan kanalına sahip standart bir uygulanan iki fotoğraflı sistemde yürütülebilir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi mikrobiyoloji ve immünoloji bölüm başkanı ve profesörü Steve Hurst; bugün prosedürü gerçekleştirecek olanlar Kishka Laboratuvarı'ndan Anita'nın oğlu ve laboratuvarımdan araştırma yardımcı profesörü Oxana Paulka'dır. NADH görüntüleme tekniğine öncülük eden Dr. Kishka, kısa süre önce Almanya'ya taşındığı için bugün burada olamıyor. Cerrahi bölge, otoklavlanmış veya %70 etanol ile dezenfekte edilmiş gerekli aletlerle hazırlandıktan ve fare %5 isoflurane ile anestezi edildikten sonra, fareyi bir ısıtıcı ped üzerine yerleştirin ve havada %1,3 ile %1,5 isoflurane vermek için bir yüz maskesi uygulayın.

Kuyruk sıkma testi yaparak anestezinin düzeyini kontrol edin. Ardından, rektal bir prob yerleştirin ve işlem boyunca hayvanın vücut sıcaklığını sürekli olarak ölçün. Farelerin gözlerinin kurumasını önlemek için gözlere suni gözyaşı jeli uygulayın.

Ardından baş bölgesindeki ve her iki uyluktaki tüyler temizlenir; kalan tüyleri temizlemek için uyluk bölgesine iki dakika boyunca tüy dökücü uygulanır, uyluk bölgesi oksimetri için kullanılacaktır. Son olarak, kafa derisi %10'luk povidon iyot çözeltisi ve %70'lik etanol kullanılarak dezenfekte edilir. Kraniyal pencere oluşturmak için kafatasına beş milimetre uzaklıktan makasla başlanır.

Kafatasında bir insizyon yapın ve bir santimetre ilerleyin. Kafatasını açığa çıkarmak için deriyi yanlara çekin. Kafatasının üzerindeki membranları temizleyin. %10'luk ferrik klorür çözeltisi uygulayın.

Fazla çözeltiyi silin ve membranları 45 derecelik bir açıyla sıyırarak uzaklaştırın. Beş numara, cımbız Kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla ilgilenilen bölgeyi belirleyin. Kafa plağının pencere kenarlarına ince bir tabaka hızlı yapıştırıcı uygulayın.

İlgi alanı pencerede görünecek şekilde baş plakasını konumlandırın ve baş plakasına hafifçe baskı uygulayın. Yapıştırıcının hızla polimerize olması için az miktarda diş dolgu çimentosu uygulayın. Yapıştırıcı polimerize olurken 10 saniye boyunca basılı tutun.

Kafa plakasını ve kafatasını mühürlemek için pencerenin kenarlarına az miktarda hızlı yapıştırıcı uygulayın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altında kafa plakasını hayvan tutucuya vidalayın. Bu işlem için 6.000 RPM'e ayarlanmış mikro torklu iki matkap seti ve IRF 0 0 5 matkap ucu kullanın.

Kafatasındaki ve baş plakasındaki tüm fazla yapıştırıcıyı temizleyin. Ardından matkabı bin RPM'e ayarlayın ve baş plakası penceresinin içinde yaklaşık beş milimetre çapında bir daire çizerek kafatasını delmeye başlayın. Çok yumuşak bir kalemle çizim yapıyormuşsunuz gibi hafif süpürme hareketleri kullanın.

Her 20 ila 30 saniyede bir delme işlemini durdurun ve kemik tozunu temizlemek için basınçlı hava kullanın. Delme işlemi ilerledikçe, merkezdeki sağlam kafatasının etrafında bir kanal oluşur. İnce kafatasını delmemeye dikkat edin, ancak bu kanalın eşit kalınlıkta olduğundan emin olun.

Ayrıca, büyük kan damarları çevresinde ekstra dikkatli olun. Bu damarlar zarar görmemeli ve mümkünse onlara hiç dokunulmamalıdır. Bir cımbız ucuyla, pencerenin merkezindeki kemiği kaldırın ve pencerenin üzerine bir damla yapay beyin omurilik sıvısı uygulayın. Bir Kim wipe köşesini kullanarak, yapay beyin omurilik sıvısını 45 derecelik bir açıyla nazikçe silin.

Beş numara, cımbız. Pencerenin kenarı boyunca hasar görmüş dura bölgesini bulun ve çıkarmak için yukarı kaldırın. Kanama meydana gelirse, bir damla yapay CSF uygulayın ve hafif kanamanın durması için iki ila üç dakika bekleyin.

Ardından, yapay beyin omurilik sıvısında çözülmüş 10 mililitre %0,07'lik düşük erime noktalı agar hazırlayın. Eritilmiş agarı vücut sıcaklığına getirin. Beyin yüzeyindeki fazla yapay beyin omurilik sıvısını silerek temizleyin.

Aerosu pencereye dökün ve üzerini bir lam ile kapatın. Ardından, cam ile baş plakası arasında temas sağlamak için camı hafifçe bastırın ve aeros katılaşana kadar 10 ila 20 saniye bekleyin. Cımbız ve yumuşak doku kağıdı kullanarak, cam örtük üzerindeki fazla aerosu temizleyin.

Camı kafa plakasına yapıştırmak için camın etrafına az miktarda hızlı yapıştırıcı sürün. Ardından, femoral vene enjeksiyon yapmak için yapıştırıcıyı sabitleyecek az miktarda dental siman uygulayın. Sol uyluğun iç kısmını açığa çıkarmak için hayvanı kısmen yan çevirin.

Hayvanı sabitlemek için bant kullanın. Bu konumdayken ciltte antiseptik scrub uygulayın ve ardından %100 etanol sürün. Daha sonra, dizden pubik senteze kadar medial uyluk boyunca bir insizyon yapın.

Gerekirse, yumuşak dokuları künt diseksiyonla ayırın. Bir mililitrelik bir şırıngayı 130 µL Texas red ile doldurun. Yeni bir 30 gauge iğne takın ve eğimi yukarıda tutarak iğneyi dikkatlice 30 derecelik bir açıyla bükün.

Bir diseksiyon mikroskobu altında iğneyi Texas Red Solüsyonu ile doldurun, iğneyi femoral vene yerleştirin ve yüz mikrolitre Texas red enjekte edin. İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için venin üzerine gazlı bezle hafifçe bastırın. Kan oksijen satürasyonunun sürekli izlenmesi için cildi dört sıfır dikişle kapatın.

Oksimetre probunu, tüyleri daha önce temizlenmiş olan sağ uyluğa yerleştirin. Görüntülemeye başlamak için cerrahi olarak hazırlanmış fareyi mikroskop tablasına aktarın. Daha yüksek büyütmedeki foton anizleriyle kayıt işlemini gerçekleştirmek için referans harita olarak kullanmak üzere, Bright Field aydınlatması altında dört x büyütmede kranial pencere bölgesinin bir başlangıç fotoğrafını çekin.

10 x büyütme kullanarak ilgilenilen alana yakınlaştırın. Kortikal katmanlarda ilgilenilen bir alan seçin. Zaman serisini kaydetmek için bir veya iki kez başlatın.

Görüntü kalitesini artırmak için ortalama üç ila beş kare kullanmanızı öneririz. Ardından, hayvanın soluduğu havaya %50 azot ekleyerek hipoksemiyi indükleyin. Bu işlem oksijen seviyesini %10'a düşürecektir. Oksimetre verilerini izleyerek hipoksemiyi doğrulayın.

Hipoksemi sırasında ve normal oksijen seviyesi geri kazanıldıktan sonra yaklaşık 30 saniye boyunca zaman serisini kaydetmeye devam edin. Kan damarları etrafındaki hipoksik ve oksijenlenmiş doku silindirlerinin alanını saptayarak, ölçerek ve nicelendirerek oksijen dağılımının hesaplanması için veri toplayın. Kurbağa doku silindir yarıçapı R'yi belirlemek için, kan damarının merkezi ile yüksek NADH floresansının saptandığı sınır arasındaki mesafeyi ölçün.

Veri işleme yöntemleri için yazılı protokole bakınız. Bu şekil, geçici hipoksemi sırasında kaydedilen videodan alınan eş zamanlı NADH ve coğrafya görüntülerini göstermektedir; solunan oksijen konsantrasyonu üç dakika boyunca %21'den %10'a düşürülmüştür. Deneysel olarak indüklenen bu hipoksemi seviyesi, serebral kortekste şiddetli hipoksiyi tetiklemek için yeterlidir.

Hipoksi, başlangıçta arteriyel kan kaynağına en uzak bölgelerde yeşil ile gösterilen NADH floresansında bir artışa yol açmıştır. Kırmızı ile gösterilen kortikal mikrosirkülasyondan oksijen difüzyonunun gözlemlenebilir doku sınırlarını temsil eden keskin NADH doku sınırlarına dikkat edin. Burada, korteksin floresanla işaretlenmiş mikrodamarlarının kırmızı renkte ve korteks gri maddesinin intrinsik NADH floresansının yeşil renkte olduğu eş zamanlı bir görüntü yer almaktadır; NADH floresans yoğunluğu dağılımı binerdir.

NADH floresansının tekdüze olarak düşük olduğu alanlar ve NADH floresansının tekdüze olarak yüksek olduğu alanlar mevcuttur. Sarı çizgiler, düşük ve yüksek NADH floresanslı alanlar arasındaki doku sınırlarını temsil etmektedir. Bu doku sınırları, yakınlardaki mikrodamarlarla mekansal bir ilişki sergilemektedir.

Bu ilişki, mikrovasküler yapılardan dokuya doğru gerçekleşen oksijen difüzyonu tarafından belirlenir. Bazı durumlarda, bu doku sınırlarının silindirik yapısı veya CRO doku silindiri, mavi çizgilerle belirtildiği gibi doğrudan tanımlanabilir. Burada, doku sınırı, merkezde eş merkezli bir kan damarı bulunan dairesel bir şekle sahiptir.

Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında 1,5 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, ödem nedeniyle kortikal yüzeyin dikey hareketini önlemek için lamel camın metal plakaya yapıştırıldığını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, doku hipoksisi ile serebrovasküler kenetlenme arasındaki ilişki gibi ek soruları yanıtalamak amacıyla fonksiyonel hiperemi ölçümleri gibi ek analizler yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare korteksindeki mikro bölgesel doku hipoksisinin nasıl görselleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.