Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu deneysel sistem, spesifik proteinlerin invazyon sürecine olan katkısını karakterize etmeyi amaçlamaktadır. İşleme, hücrelerin ilgilenilen floresan protein ile retroviral transdüksiyonu ile başlayın. Ayrıca transwell insertlerde matrigel proteininden 3D matriks oluşturun ve uygun dilüsyonda bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Matrigel transwell sistemini kullanarak, test ilaçları veya tedavilerle birlikte kemo atraktanta karşı transmigration yanıtını ölçün; ardından konfokal mikroskopi ile hücre invazyonunu görselleştirme ve analiz etme işlemine geçin. Nihayetinde, sonuçlar üç boyutlu protein matrisine hücre invazyonunun boyutunu ve modunu belirleyebilir. Bu tekniğin, geleneksel Transwell invazyon analizi gibi mevcut yöntemlere göre gücü, üç boyutlu bir protein matrisine hücre invazyonu hakkında hem kantitatif hem de kalitatif veriler sağlama kapasitesidir.

İş birliği yaptığım Diane Creighton, şimdi %10 FBS içeren DMEM ortamında retroviral paketleme hücrelerinin 48 saat boyunca kültüre edilmesi yöntemini gösterecek. Hücreleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak retroviral DNA ile transfekte edin. 24 saat inkübe edin, kuyucukları besiyeri ile iki kez durulayın, ardından her kuyucuğa 1,5 mililitre %10 FBS-DMEM ekleyin ve paketlenmiş Retrovirüsleri toplamak için 48 saat inkübe edin.

Doku kültürü besiyerini iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın, hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatantı temiz bir tüpe toplayın. Bu retrovirüs stokunu eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Retrotransdüksiyon yapılacak hücreler için, gece boyunca kültüre edilen ortamdaki medyayı uzaklaştırın ve poly green ile desteklenmiş bir mililitre retrovirüs stoku ekleyin.

Altı saatlik inkübasyonun ardından, kuyucuğa iki mililitre %10 F-B-S-D-M-E-M ekleyin ve plakları 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Gecelik olarak medyumu yenileyin ve 24 saat sonra uygun seçici medyumu ekleyin; hücreler konflüent hale geldiğinde hücreleri hasat edin ve transduk edilmemiş hücreleri referans alarak floresan özelliğine göre ayıklayın. Transduk edilmemiş hücrelerden daha yüksek floresansa sahip olan hücreleri toplayın ve gelecekte kullanmak üzere alikotları -80 °C'de dondurun.

Bu yöntem, görüntüleme için floresan proteinlerin ekspresyonuna dayanır ve bireysel hücrelerin katkılarının belirlenmesine yönelik içgörüler sağlar. Matrigel'i buz üzerinde çözün ve ardından buz soğukluğundaki PBS ile bire bir oranında seyreltin. Şimdi, kaplanmamış transwell'leri 24 kuyucuklu bir doku kültür plağına yerleştirin.

Ardından, kuyucuklara dikkatlice 100 µL seyreltilmiş matri gel pipetleyin ve 37 °C'de katılaşmaya bırakın. Bu sırada, floresan işaretli hücre süspansiyonlarını normal büyüme ortamlarında hazırlayın. Matri gel katılaştığında, transwell'leri ters çevirin ve filtrelerin çıkışa bakan alt kısmına 100 µL hücre süspansiyonu pipetleyin.

Transwell'leri, her bir hücre süspansiyon damlacığına temas edecek şekilde 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının tabanıyla dikkatlice kapatın. Hücrelerin tutunmasına izin vermek için plağı ters konumda dört saat boyunca inkübe edin. Ardından plakları düz konuma getirin ve her bir transwell'i bir mililitrelik serumsuz besiyerine iki kez daldırarak yıkayın.

Ardından transwell'i, herhangi bir ilaç veya tedavi reaktifleri içeren üçüncü bir kuyucuğa yerleştirin. Kemotaktik çekici içeren 100 µL medyum, katılaşmış matrigel PBS karışımının üzerine, transwell'e nazikçe pipetleyin. Matrigel'e invaze olan floresan dışı hücreleri görüntülemek için %5 karbon dioksit ile 37 °C'de üç ila beş gün boyunca inkübe edin.

Transwell'leri taze 24 kuyucuklu plaklara yerleştirin ve her bir matrigel tıpasının üzerine bir mililitre dört mikromolar kalsiyum AM çözeltisi pipetleyin; çözeltinin yanlardan taşmasına ve hem üstten hem alttan boyama yapmasına izin verin. %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.

Bu ilk yaşam tarzı boyama yöntemi, invazyon modlarının görselleştirilmesine olanak tanır. Her bir transwell'i taze bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın, üzerine 1 mL %4 paraformaldehit ve %0,2 triton X 100 ekleyin ve oda sıcaklığında yarım saat boyunca inkübe edin. 1 mL PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, 0,01 mg/mL konsantrasyonda görselleştirme için 30 dakika boyunca RNase A ekleyin ve ardından PBS ile iki kez yıkayın.

Propidium iyodürü PBS ile seyreltin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bekletin. PBS ile üç kez yıkayın. Bu aşamada, propidium iyodürü ile boyanmış transwell'ler oda sıcaklığında karanlıkta en az bir ay boyunca saklanabilir.

İkinci hücre boyama yöntemi fiksasyon gerektirir, ancak invazyonun daha hızlı şekilde nicelleştirilmesine olanak tanır. Küçük bir miktar kalıntı PBS içeren transwell'i, invers confocal mikroskop altında, imersiyon olmayan 20x objektif üzerine yerleştirilmiş büyük bir lam üzerine yerleştirin ve matrigel tıkanın tabanından başlayarak her 10 ila 15 mikronda bir optik kesitler alın. Tekil optik dilimleri kullanarak invazyonun derecesini nicelleştirin. Ayrıca, söz konusu optik dilim serilerini kullanarak Velocity gibi uygun bir yazılımla üç boyutlu nesneler oluşturun; hücreler calcium am ile boyanmıştır.

Beklendiği gibi, filtreden yukarıya doğru invaze olan hücre sayısı mesafe arttıkça azalmaktadır. Bu invazyon miktarsal olarak belirlenebilir. Hücre invazyonunun üç boyutlu rekonstrüksiyonları, invazyon modunun görsel bir tasvirini sunar.

Hücreler floresan protein ekspresyonu ile etiketlenmişse, her bir renkli hücrenin konumları bu yan görünümde gösterildiği gibi üç boyutlu rekonstrüksiyonlarla görselleştirilebilir. Ayrıca, rekonstrüksiyon üzerinden alınan kesitler moleküler mekanizmalar hakkında içgörüler sunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, standart yöntemlerle elde edilebilenden daha fazla bilgi edinmek için bu hücre invazyon testi yönteminin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.