Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Bu videonun genel amacı, kalsiyuma duyarlı floresan indikatör kullanarak gelişmekte olan kortikal beyin kesitlerinden ağ aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermektir. DY beyin kesitleri, genç bir farenin gelişmekte olan enteral korteksinden hazırlanır. Hem nöronlar hem de astrositler kalsiyum bağımlı markerlar ile yüklenir.

Kalsiyum bağımlı boyaların floresanındaki değişimler, hücresel aktivitedeki değişimleri yansıtır. Astrositler, mikroglialar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere nöronal olmayan hücreler, spesifik marker boyalar kullanılarak boyanabilir. Kortikal ağ aktivitesi, zaman ayarlı Multiphoton görüntüleme ile kaydedilir; ağ içindeki hücreler, ilgi bölgesinden 3D görüntü yığınları oluşturularak tespit edilir.

Birden fazla hücredeki hücresel floresans değişiklikleri, gelişmekte olan kortikal ağın aktivitesini okumak için analiz edilebilir. Gelişen sinir sistemindeki karakteristik bir aktivite paterni, spontan senkronize ağ aktivitesidir. Senkronize aktivite, sağlam spinal kord korteksi ve disosiye nöronal kültür preparatları da dahil olmak üzere, gelişmekte olan birçok farklı nöronal bölgede; nöronların ateşleme için depolarize olduğu, birçok voltaj kapılı kalsiyum kanalı da dahil olmak üzere birçok iyon kanalını aktive eden tekli spike'lar veya aksiyon potansiyeli burst'leri ile kalsiyum girişine yol açtığı spontan aktivite dönemlerinde gözlemlenmiştir.

Yerel ağlardan gelen yüksek derecede senkronize aktivite, alan elektrotları veya çoklu elektrot dizileri kullanılarak ölçülmüştür. Bunlar yüksek zamansal örnekleme hızlarına olanak tanır, ancak hücre aktivitesinin entegre okuması nedeniyle daha düşük uzamsal çözünürlük sunar. Nöronal aktivitenin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesi, ateşleme hızlarını belirlemek için tekil nöronların patch clamp elektrofizyolojisi kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Ancak, bir ağdan ölçüm yapabilme yeteneği aynı anda yamalanan nöron sayısıyla sınırlıdır ve genellikle sadece bir veya iki nörondur. Kalsiyum bağımlı floresan indikatör boyaların kullanımı, bir hücre ağı boyunca senkronize aktivitenin ölçülmesini mümkün kılmıştır. Bu teknik, gelişen ağın spontan aktivitesini kaydetmek için hem yüksek mekansal çözünürlük hem de yeterli zamansal örnekleme sağlar.

URA 2:00 AM ester gibi floresan kalsiyum duyarlı indikatörler, kalsiyum iyonlarına bağlanabilen karboksilik asit grupları içerir. Bu floresan boyalar, tek fotonlu veya iki fotonlu mikroskopi kullanılarak belirli ışık dalga boyları ile aktive edilir. Boyadan yayılan foton sayısı, kalsiyuma bağlanma gerçekleştiğinde geçici olarak değişir.

Foton sayısındaki veya floresan düzeyindeki bu değişim, delta FF sinyali olarak rapor edilir ve nöron içindeki kalsiyum seviyesindeki bir değişime karşılık gelir. Kalsiyuma duyarlı indikatörlerdeki değişimlerin ölçümü, gelişmekte olan hücrelerdeki ağ aktivite modellerinin yararlı bir okuma ölçütüdür. Merhaba, ben Rianna Morty ve benim adım Julie Abbots.

Amsterdam'daki üniversitenin Yorumlayıcı Nörofizyoloji Bölümü'nden geliyoruz. Çok odaklı görüntülemede kalsiyum duyarlı indikatörler kullanarak, fare korteksindeki gelişmekte olan dokudaki fonksiyonel aktiviteyi incelemek için kalsiyum görüntüleme yöntemini kullanmaktayız. Bu kısa filmin amacı, bu yöntemlerin sinir sistemindeki gelişen ağlarda hem spontan hem de uyarılmış aktivite modellerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

Nöral devrelerdeki hasarı azaltmak için genç bir farenin beynini hızla kafatasından çıkarın. Beyni buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu içinde diseke edin. Dilimleme solüsyonu, nöronal kayıtlar için A TSF'de yaygın olarak kullanılan sodyum yerine kolin klorür içerir.

Bu deneylerde, gelişmekte olan fare beyninin enteral korteksinden beyin dilimleri hazırlıyoruz. Bir petri kabının üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve birkaç mililitre A TSF ile ıslatın. Beyni filtre kağıdının üzerine aktarın.

Hemisferleri tek kenarlı bir jiletle ikiye bölün. İki hemisferi birbirinden ayırın. Hemisferlerden birini, diğer hemisferle birlikte buzlu dilimleme solüsyonuna geri yerleştirin.

Jiletle serebellumu çıkarın. Hemisferlerden birini orta hattına doğru katlayın ve bıçağı hafif bir açıyla rostral uca doğru tutarak dorsal yüzeyden yaklaşık bir milimetrelik bir kesi yapın. Beyni ters çevirin.

Pamuklu aplik ve metal spatula kullanarak yakın zamanda kesilmiş yüzeyi temizleyin. Beyni metal kesme bloğuna aktarın. Beyni spatula üzerinden pamuklu aplikle hafifçe iterek yapışkanlı yüzeye yerleştirin.

Beynin 300 µm kalınlığındaki dilimleri kesilir; genç dokular için kesme hızları ve bıçak frekansları genellikle daha olgun dokular için kullanılanlardan daha düşüktür. Kesilen her dilim, bir cam pipet kullanılarak oda sıcaklığındaki oksijenlenmiş A-TSF içeren tutma haznesine aktarılır. A-CSF, A-CSF çözeltisine göre daha yüksek bir magnezyum/kalsiyum oranına sahiptir.

Kayıt için kullanılan kesitlerin toparlanması için bir saat beklenir. Hücreleri kalsiyuma bağımlı bir indikatör veya hücreye özgü bir işaretleyici ile yüklemek için kesitlerin boyama prosedürü için bir hazneye aktarılması gerekir. Ticari hazneler mevcut olsa da, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak çok düşük bir maliyetle kolayca bir hazne monte edilebilir.

Bir boyama odası hazırlamak için şu temel laboratuvar ekipmanlarına ihtiyacınız olacaktır: iki adet plastik petri kabı, bir adet 10 milliliter şırınga, bir parça silika tüp, yarı geçirgen membranlı bir hücre kültürü inserti, hızlı yapıştırıcı, üç adet küçük tüp konnektörü ve ince uçlu bir iğne. Büyük Petri kabını alın ve ısıtılmış bir çubukla yan duvardan küçük bir delik açın. Küçük Petri kabını alın ve silikon tüpün geçebileceği büyüklükte, benzer çapta bir delik açın.

Silikon tüpün bir bölümünü delikten geçirin ve küçük kabın içinde bir halka oluşturun. Tüpün açık ucunu kapatmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Ardından, tüpün geri kalan kısmını küçük petri kabının iç duvarına yapıştırın.

Küçük petri kabını büyüğünün merkezine yerleştirin ve yapıştırın. Silikon tüpün kalan ucunu alın ve petri kabının yan duvarındaki küçük delikten geçirin. İnce bir iğne kullanarak, petri kabının içindeki silikon tüpte küçük delikler açın.

Gaz geçirgenliğinin dengeli olması için delikleri eşit aralıklarla açın. Isıtılmış bir bistüri kullanarak, yarı geçirgen membranlı bir hücre kültür kuyucuğu alın. İnkübasyon sırasında dilimleri tutmak için sığ bir kap oluşturacak şekilde, kuyucuğun üstten bir santimetresini kesin.

Sığ kabı, gözenekli silikon tüplerle çevrili küçük kabın merkezine yerleştirin. Büyük kabın kapağına yaklaşık yarım ila bir santimetre çapında bir delik açın. Isıtılmış bir bistüri kullanarak 10 mililitrelik plastik bir şırınga alın.

Şırınganın ucunu çıkarmak için açılı bir kesik yapın. Şırınga tüpünün kesilen yüzeyine hızlı yapıştırıcı sürün. Bunu, büyük Petri kabı kapağındaki deliğin üzerine doğrudan yapıştırın.

Şırınga ucunun sonuna bir hortum konnektörü takın. Gözenekli gaz hortumunun sığ kabın etrafında yer aldığından emin olarak, sığ kabı küçük Petri kabının merkezine yerleştirin. Bu hortum, ardından kesitleri oksijenlendirmek için bir karbogen gaz kaynağına bağlanır.

İnkübasyon sırasında, şırınga ucu aracılığıyla gaz kaynağına doğrudan bağlı olan geniş petri kabının kapağını kapatın. Bu işlem, boyanın solmasını önlemek için inkübasyon süresince kesitlerin üzerine karbonat ve gaz akışı sağlayacaktır. Tüm işlemler mümkün olduğunca az ışık altında gerçekleştirilmeli; hem boya hem de kesitler karanlıkta tutulmalıdır.

Boyama haznesini, dilim tutucusundan yaklaşık bir buçuk mililitre A TSF ile doldurun. Arayüz haznesini içeri yerleştirin ve bir mililitre daha A TSF ile doldurun. Dokunun sağlıklı kalması ve dilimin iyi yüklenmesi için iyi bir oksijen kaynağının sürdürülmesi önemlidir.

Boyama odası ısınırken, boyanın nöronlar tarafından alınımını kolaylaştırmak için boyama yaklaşık 35 °C'de gerçekleştirilir. fira 2:00 AM Ester için indikatör boyayı hazırlayın. 50 µg'lık bir flakona dokuz µL DMSO ile bir µL onik asit ekleyin.

DMSO ve onik asit. Boyanın lipid membran aracılığıyla alınmasını sağlamak için geçirgenlik artırıcı ajanlar olarak görev yaparlar. Boyanın tamamen çözündüğünden emin olmak için flakonu 15 dakika boyunca vorteksleyin.

Boyama için, her kesiti ara yüze aktarın. Boyama haznesine yerleştirin. Boyayı kesitlerin üzerindeki ilgi bölgesine doğrudan damlatın ve boyama haznesinin kapağını kapatın.

Kesitleri, kullanılan farelerin yaşına bağlı olarak 20 ila 40 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. İnkübasyon sonrası, kalan fazla boyayı yıkamak için kesitleri tekrar kesit tutucuya aktarın. Kalsiyum görüntüleme için kullanılan boyama protokolleri, daha yaşlı dokulara göre de uyarlanabilir.

Bu işlem, ek bir ön inkübasyon adımı gerektirir. Eski kesitleri, 3 mL CSF ve %0,5'lik 8 µL crema four çözeltisi ile doldurulmuş sığ bir ön inkübasyon kabına aktarın. Üç dakika boyunca 35 °C'ye ısıtın. Ardından kesitleri arayüze aktarın, boyama haznesine yerleştirin ve normal boyama prosedürlerini izleyin.

Bu kesitlerin nöronal olmayan hücreler, yani astrositler, mikroglialar ve endotel hücreler için boyanması da mümkündür. Astrositleri sülfür domini için boyamak amacıyla Sülfur rumine 1 0 1 kullanılabilir. 10 µM'lık bir çözelti hazırlayın ve mor boyayı kesitlerdeki ilgili bölge üzerine pipetleyin.

15 dakika boyunca inkübasyona bırakın. Fazla boyayı uzaklaştırmak için kesitleri tutma haznesine geri aktarın. Domates lektininin FSE konjuge formu, mikroglia ve endotel hücrelerini boyamak için kullanılabilir.

Domates lektini için mililitre başına 20 mikrogramlık bir çözelti hazırlayın. Boyayı kesitlerdeki ilgili bölgenin üzerine damlatın. Kesitleri 45 dakika boyunca inkübasyona bırakın.

Ardından kesitleri bir kez daha tutma haznesine aktarın. Görüntüleme sırasında kesitlerin mikroskop altında sabit kalması gerekir. Genellikle dokuyu sabit tutmak için metal bir arp yerleştirilir; ancak bu, kesitin yüzeyini düzensiz bir şekilde bozarak görüntüleme için odak içinde yalnızca sınırlı bir görüş alanı sağlayabilir ve bundan kaçınılmalıdır.

Bu dilimler, POLİETİLEN veya PEI çözeltisi kullanılarak kayıt odasına sabitlenir. PEI, hücrelerin bir yüzeye tutunmasını artırmak için en az bir saat boyunca kullanılan bir polimerdir. Dilimleri kayıt odalarına yerleştirmeden önce, odanın tabanını kaplayacak şekilde birkaç mililitre PEI çözeltisi ile doldurun.

Öncelikle, oda içerisindeki PEI'yi önce distile su, ardından CSF çözeltisi ile durulayın. Bir kesiti kayıt odasına aktarın ve fazla A CSF çözeltisini uzaklaştırın. Kesiti, ince uçlu bir boya fırçası kullanarak odanın ortasına yerleştirin.

Kalan tüm A CSF'yi emici filtre kağıdının küçük parçalarını kullanarak temizleyin. Kesitin kenarlarında artık A CSF kalmadığından emin olun. Son olarak, kesiti bölmeden nazikçe üzerine yarım mililitre A CSF damlatın.

Kamaraları oksijenle doyurulmuş büyük bir ara yüz kabına yerleştirin ve bir saat daha karanlıkta bekletin. Kalsiyum duyarlı indikatör boyalardaki değişimler, tek veya çift foton mikroskobu ile kaydedilebilir. Nöronal ağlarımızda çift foton görüntüleme yapabilmek için Olympus mikroskobuna bağlı bir titanyum safir lazer kullanıyoruz.

Ek olarak, artırılmış kare tarama hızları için EM CCD hammer MATSU kameralı bir L Vision biotech trim scope sistemi kullanıyoruz. Dilim odasını, 1,6 millimolar kalsiyum ve 1,5 millimolar magnezyum içeren oksijenlendirilmiş A-T-S-F-A-T-S-F'nin stabil akışının olduğu mikroskobun altına yerleştirin. Düzenek, beyaz ışık kullanılarak yaklaşık 30 °C'ye ısıtılır.

Kesitteki ilgi bölgesini belirleyin ve yüzeye odaklayın. Işıkları kapatın ve kayıt kabininin kapısını kapatın. Bu işlem, arka plan ışık seviyelerini azaltmak içindir.

Görüntüleri kaydetmek ve analiz etmek için birçok farklı ticari veya açık kaynaklı yazılım paketi mevcuttur. Laboratuvarımızda, görüntüleme işlemi için Lavis Biotech'in inspector yazılımını kullanıyoruz. Görüntülemeye başlamak için deteksiyon amacıyla CCD kamera modunu seçin. İndikatörünüz için ilgili dalga boyunu ayarlayın.

Fira 2:00 AM Ester için, trim scope yazılımında eksitasyonu 820 nanometreye ayarladık. 64 B tarama modunu seçin. İlgilendiğiniz bölge için optimal görüş alanı boyutunu ve piksel çözünürlüğünü belirleyin.

Görüntü örneklemeniz için uygun bir kare hızı ve gerekliyse piksel döndürme (pixel spinning) seçin. Sürekli görüntüleme için lazer kepenklerini açın. Sürekli görüntüleme modunu kullanın.

Kazancı ve lazer yoğunluğunu ayarlayın ve görüntülemek istediğiniz nöronal ağa odaklanın. Taramayı durdurun. Kare hızı ve sekans süresi için zamanlapse ayarlarını seçin.

Zamanla seyreden (time-lapse) görüntülemenin ardından, 1 mikronluk adımlarla 20 mikron yukarısını ve 20 mikron aşağısını kapsayan bir Z yığını (Z stack) görüntü oluşturun. Bu Z yığını, analiz sırasında hücre tespiti için kullanılır. Kaydedilen dosyaları bir TIFF görüntü yığını olarak dışa aktarın.

Sonuç olarak, gelişmekte olan korteksteki senkronize spontan ağ aktivitesini ölçmek için kalsiyum indikatörlerinin kullanımını göstermiş olduk. Tekniği kendi laboratuvarınızda kurabilmeniz için metodoloji ve reaktifler hakkında daha fazla ayrıntı, bu filme eşlik eden veri sayfalarında bulunabilir.