Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, video zaman atlamalı mikroskopi kullanarak hücrelerin migrasyonunu gerçek zamanlı olarak nicel bir şekilde ölçmektir. Bu işlem, önce altı kuyucuklu bir kültür plağının kolajen ile kaplanması ve ardından ilgili hücrelerin kaplı plağa seyrek bir şekilde ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, migrasyon için yeterli alan sağlamak amacıyla bir pipet ucu kullanılarak plak üzerinde bir yara oluşturulur.

Ardından, göç eden hücrelerin gerçek zamanlı olarak sürekli izlenmesine olanak sağlamak için bir sıcaklık kontrol sistemi kullanılarak mikroskop kurulumu yapılır ve düzenli aralıklarla görüntüler alınır. Son olarak, test ve kontrol hücrelerinin ortalama hızları ve toplam yer değiştirmelerindeki farkları değerlendirmek için partikül izleme protokolü kullanılır. Bu tekniğin, kaçınma odası göç deneyi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nihai nokta kantitatif göç ölçümlerine dayanmıyor olmasıdır.

Bunun yerine, farklı parametrelerin sürekli olarak izlenmesine ve hesaplanmasına olanak tanır. Bu yöntem, kanser biyolojisi alanındaki belirli genlerin veya ilaçların tümör hücresi migrasyonunu nasıl etkilediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürden iki gün önce, altı kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna opti medyumda seyreltilmiş 1,5 milliliters collagen ekleyin ve ardından plağı prosedürden bir gün önce dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

İlgili hücreleri kuyuk başına 2 mL DMEM artı FBS içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri kolajen ENC kaplı plakanın her bir kuyusuna aktararak hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Prosedür gününde, gece boyu kültüre edilen hücrelerde bir pipet ucu kullanarak yara oluşturun ve yara sonucunda oluşan kalıntıları temizlemek için her bir kuyuyu PBS ile yıkayın.

Durulanan kuyucuklara FBS eklenmiş DMEM ekleyin ve ardından temiz bir yara boşluğu oluştuğunu onaylamak için mikroskop altında kontrol edin. Mikroskop kamerasını ve canlı hücre görüntüleme aparatını açtıktan sonra, plakayı mikroskop tablası üzerine yerleştirin. Plakayı yeni canlı hücre çevresel kontrol odacığı ile kapatın, termostatı 37 °C'ye ve karbondioksiti %5'e ayarlayın. Şimdi menü çubuğunda bulunan slayt defteri yazılımını açın.

Daire içindeki F butonuna tıklayarak odak kontrolünü seçin. Objektif kutusundaki açılır pencereyi kullanarak objektifi tanımlayın. Filtre seti kutusunda, ışık yolunu I parçasına yönlendirmek için ayarları seçin. Aydınlık Alan Aydınlatması için uygun filtreyi seçin ve ardından açık Aydınlık seçeneğine tıklayın.

Aydınlık alan dekansını açın. Şimdi taret üzerindeki aydınlık alan filtresini seçin ve uygun alanları bulmak ve örneği odaklamak için okülerden örneği görüntüleyin. Ardından, ışık yolunu kameraya yönlendirmek için filtre taretini hareket ettirin. Slayt kitabı yazılımında görüntü yakalamak için, oküler aracılığıyla farklı konumlar seçmek üzere odak kontrolüne tıklayıp XY'yi seçin ve ardından her bir konumu sabitlemek için nokta belirle'ye tıklayın.

Görüntü yakalama işlemi için, ekranda görüntülenen kamera görüntüsünün odağını manuel olarak ince ayarla yapın ve ardından sahnenin Z konumunu ayarlamak için odak kontrol penceresindeki araçları kullanın. En iyi sonuçlar için, odaklamaya yardımcı olması amacıyla plakaya temas eden bölgelere yakın, düz hücresel çıkıntılara odaklanın. Odaklama için uygun bir pozlama süresi aralığı ayarlamak üzere kaydırıcıyı kullanın.

Birden fazla XY konumu seçilmişse, odak kontrolünü seçerek her bir konum için odağı ayarlayın. Ardından xy, sonra da visit point seçeneğini belirleyin. Slide book içerisinde, menü çubuğundan kamera grafiğini seçin, yakalama türünü (capture type) belirleyin ve ardından deney süresini seçmek için time lapse seçeneğine tıklayın.

Açılır menüden, bir zaman noktasının başlangıcı ile bir sonrakinin başlangıcı arasında istenen gecikme süresini girin. Aralık alanlarında, üçüncü alan manuel olarak girilen değerlerden otomatik olarak hesaplanacaktır. Çoklu XY yakalama başlığı altında, birden fazla XY konumunun olduğu deneyler için çok noktalı liste seçeneğini belirleyin.

Son olarak, dosyayı kaydetmek için bir isim verin, görüntüleme kontrolüne gidin ve gelişmiş seçeneğinden spool'u seçin. Ardından, her zaman noktasından sonra belleğe aktarın ve spool dosyasına kaydedin. İşleme görüntüye tıklayarak başlayın.

Slayt kitabı menü çubuğunda, açılır menüden içe aktar (import) seçeneğini seçin ve ardından slayt kitabı kuyruğuna (slide book spool) tıklayın. Çeşitli alanlar ve zaman noktaları için migrasyon deneyinden elde edilen istenen slayt kitabı dosyalarını seçin. İlk dosyayı açın, ardından menü çubuğunda maske (mask) seçeneğini seçin ve açılır menüden partikül izleme protokolünü (particle tracking protocol) belirleyin.

Parçacık izleme menüsü altında, manuel parçacık izleme protokolünü seçin. Başlangıç ve bitiş zaman noktalarının bulunduğu bir pencere açılacaktır. Rastgele göçü analiz etmek için maskeyi ve ardından parçacık izleme protokolünü seçin. Nesnenin merkez koordinatlarını belirlemek için tekrar alan merkezini seçin.

Ardından track (izle) düğmesine tıklayıp devam edin. Şimdi, yer değiştirme ve ortalama hız gibi her yol için istenen istatistikleri seçin. Burada gösterildiği gibi, istatistikleri görüntülemek için calculate (hesapla) düğmesine tıklayın.

Hız cinsinden nicelleştirilmiş rastgele migrasyon analizine bir örnek bu kutuda gösterilmiştir. Whiskers grafiğinde, bu deneyde, tümör baskılayıcı geni nakavt edilmiş M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinde ortalama hızda bir artış görülmüştür. Buradaki kontrol M-D-A-M-B 2 31 hücreleri ile karşılaştırıldığında, ilk figürdeki hücrelerin rastgele migrasyonu hücre yer değiştirmesi açısından analiz edilmiştir.

Yeniden, toplam tümör baskılayıcı gen knockdown grubu, kontrol M-D-A-M-B 2 31'e kıyasla artmış hücre yer değiştirmesi göstermiştir. Bu zaman atlamalı video mikroskopi filmindeki hücrelerde, kontrol MDA MB 2 31 hücreleri gece boyunca kollajen üzerine yerleştirilmiştir. Görüntüler daha sonra rastgele göç sırasında toplam 18 saat boyunca bir saatlik aralıklarla alınmıştır.

Hücrelerin zamanla orijinal konumlarından nasıl uzaklaştıklarına dikkat edin. Bu videoda, kolajen üzerine gece boyu ekim sonrası test M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinin migrasyonu kaydedilmiş ve analiz edilmiştir. Test hücrelerinin, önceki videodaki kontrol hücrelerine kıyasla daha migratif olduğuna dikkat edin.

Bu prosedürün ardından, kanser metastazının gelişimi sonrasında hücrelerin rollerinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla hücre invazyonu ve dynas gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların izole kanser hücre hatlarını kullanarak hücre migrasyonunu incelemelerinin önünü açmıştır.