Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Bu protokol, pluripotent insan embriyonik kök hücrelerini kapsüllemek ve bunları 3D bir sistemde dopaminerjik nöronlara farklılaştırmak için optimize edilmiştir. İlk olarak, kolonileri rock inhibitörü veya RI ile tedavi edin ve sodyum aljinat ile karıştırılmış solüsyonla tekil hücrelere ayırarak kapsülleme cihazından geçirin. RI tedavisine üç gün boyunca devam edin, kapsüllenen hücreleri PA altı hücrelerine aktarın ve 28 gün boyunca farklılaştırın.

Sonuç olarak, gen ve protein ekspresyon analizleri, dopaminerjik nöronların oluşturulmasında daha yüksek bir verimlilik olduğunu göstermektedir. Bu özel tekniğin mevcut 2D diferansiyasyon protokolüne göre temel avantajı, bu hücreleri 3D ortam altında çoğaltmaya ve diferansiyate etmeye çalışmamızdır; bu 3D ortam, hücrelerin yüksek yoğunlukta çoğaltılabilmesine imkan tanır. Ayrıca bu durum, diferansiyasyon için daha iyi bir hücreden hücreye etkileşim fırsatı sağlar.

Ve üçüncü olarak, ilerleyen aşamalarda size daha iyi bir farklılaşma verimliliği sağlayacaktır. Ayrıca şunu da ekleyebilirim ki, bu özel teknik, 3D ortamda çoğaltabileceğimiz diğer hücre tipleri için de uyarlanabilir. Ayrıca unutmayın, örneğin, bu özel teknik, hücre apoptozunu ve hücrelerin kültür kaplarından ayrılmasını önleyen belirli bir rock inhibitörünün kullanımına dayanarak optimize edilmiştir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, bu teknik tipik olarak doku kültüründe uygulanmadığı için başlangıçta zorlanacaklardır. Aşağıdaki enkapsülasyon tekniği; Dr. Dean ve Dr. Chad'in R inhibitör tipi alginat uygulaması, alginat konsantrasyonu ve enkapsülasyon cihazı ayarları üzerine yaptıkları özet çalışmalara dayanarak optimize edilmiştir. Laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi olan Jamie ve Kim, şimdi bu protokolü uygulamalı olarak gösterecekler.

Steril bir 50 mililitre tüp içerisindeki 275 miligram saflaştırılmış sodyum aljinata, 25 mililitre steril %0,1 jelatin çözeltisi ekleyin ve aljinat tozunu kısmen çözmek için vorteksleyin. Ardından tüpü, gece boyunca 10 kat G kuvvetinde bir orbital karıştırıcıya yerleştirin. Son olarak, aljinat çözeltisine %9 steril sodyum klorür ekleyin.

30 saniye boyunca vortexleyin ve ardından 95 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Aljinat çözeltisini dört °C'de saklayın. İlk olarak karanlık bir ortamda, insan embriyonik kök hücrelerini 10 µM rock inhibitörü ile desteklenmiş kültür medyasıyla ön işlemden geçirin.

37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri enzimatik olarak yerinden çıkarmak için DPBS ile iki kez yıkayın. Accutane ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.

37 °C'de, hücreleri bir hücre kazıyıcıyla nazikçe toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Accutane'i eşit hacimde SL ortamı ile nötralize edin. Ardından, nötralize edilen hücreleri 40 µm'lik bir filtreden geçirerek yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.

Şimdi hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Hücreleri santrifüjle çöktürün ve süpernatanı dikkatlice boşaltın. Ardından hücreleri önceden ısıtılmış solüsyonla bir kez yıkayın.

%0,9 sodyum klorür. Pelleti santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. İnsan embriyonik kök hücrelerini kapsüllemek için, önce hücreleri önceden ısıtılmış aljinat çözeltisi ile yeniden süspanse ederek başlayın.

Bunu yapmak için, 20 mililitrelik bir şırıngayı yumuşak plastik bir hortuma bağlayın ve alginatı şırıngaya çekin. Ardından, kabarcık oluşmasına izin vermeden, şırıngayı kullanarak hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın. Şimdi hücreleri şırıngaya çekin.

Plastik tüpleri atın ve ardından şırıngayı enkapsülasyon makinesine bağlayın. Boncuk oluşturucu, şırınga pompası, hava akış ölçer ve kalsiyum klorür çöktürme banyosunun cihaz kurulumuna geçin. Enkapsülasyon makinesinin ucu ile Petri kabı toplama noktası arasında 10 santimetre boşluk olduğunu doğrulayın.

Ardından, şırınga pompasını saatte 10 mililitreye ayarlayın. Hava akış hızını dakikada sekiz litre ve basıncı 100 kilo pascale ayarlayın. Kapsüllenmiş hücreleri yedi dakika boyunca önceden ısıtılmış bir çöktürme banyosunda toplayın.

Ardından bunları, nazikçe aspire ederek 20 mL 0.9% Sodium chloride içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın; kapsüllerin tüpün dibine çökmesini bekleyin, supernatantı nazikçe uzaklaştırın ve ardından 0.9% Sodium chloride ile bir kez yıkayın. Kapsüllenmiş hücreleri, rock inhibitörü ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir kültür balonuna aktarın ve üç gün boyunca inkübe edin.

Fare stromal hattı PA six hücrelerini %0,1 jelatin kaplı bir T 75 flaskına ekimleyin ve dopaminerjik nöral diferansiyasyon ortamında 24 saat boyunca kondisyonlayın. Kapsülleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpün dibine çökmelerini bekleyin. Süpernatantı atın ve kapsülleri PA six hücre kondisyonlu dopaminerjik nöral diferansiyasyon ortamında yeniden süspande edin.

Besiyeri kültürü. Kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücreleri, PA altı hücre monotabakası ile 21 gün boyunca inkübe edilir. Besiyeri yenileme işlemleri sırasında değişim yapılır.

Dopaminerjik nöral farklılaşmadaki PA altı hücrelerini kültüre etmeye devam etmek için her seferinde besiyerinin yalnızca yarısı değiştirilir. Besiyeri bir hafta boyunca indüksiyon faktörleri ile desteklenir. İlk olarak kapsülleri aspire edin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kapsüller dibe çöktüğünde, süpernatantı atın. Süpernatantı her defasında atarak DPBS ile iki kez yıkayın. Ardından beş mililitre dekapsülasyon çözeltisi ekleyin ve süspansiyonu iyice karıştırın.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Pellet santrifüj edildikten sonra, decap hücrelerini ayırın ve DPBS ile iki kez yıkayın; ardından decap hücrelerini ya monokatman kültür olarak ya da hemen ardından yapılacak analizler için kullanın. Tipik bir hazırlıkta, alginat mikro kapsüllerin çapı 400 ile 500 mikron arasındadır.

Burada, C-F-D-A-P-I analizi uygulanmıştır. Sonuçlar, canlı kapsüllenmiş hücrelerin %80 analizlerinde yeşil renkte olduğunu belirlemiştir; kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin farklı zaman noktalarındaki canlılık, proliferasyon ve apoptoz analizleri, kültür koşullarını optimize etmeye hizmet etmektedir. İlginç bir şekilde, rock inhibitörü etkileri disosyasyon kaynaklı apoptozu önlemekte ve H-F-F-C-M artı ri içerisinde kültüre edilen kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin üstün büyüme belirtisiyle hücre canlılığını korumaktadır.

Bu örnek, kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerini dopaminerjik nöronlara farklılaştırmak için 3 boyutlu bir platform olarak hücre enkapsülasyonunu uygulamaktadır. Beklendiği üzere, embriyo gövdelerinin boyutu zamanla artar; dekapsülasyon sonrası hücreler, iki ila üç günlük kültürden sonra %90'ın üzerinde canlılık göstererek ilerleyici nöronal morfoloji sergiler. Gen ekspresyon analizi, pluripotent marker OCT four'un aşağı regüle olduğunu göstermektedir.

Önemli bir nokta olarak, nöral progenitör belirteci PAC six ve dopaminerjik nöronal belirteç th, yedi günlük farklılaşmadan sonra da yukarı regüle kalmaya devam etmektedir. Daha ileri düzeyde farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücreleri, 21 gün sonra %90'dan fazla TH pozitif nöron göstermektedir. Western blot analizi, 3D hücre kültürü sistemlerinin 2D sistemlere kıyasla TH ve PAC six'in uygun ekspresyon modellerine sahip olduğunu doğrulamaktadır.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, iki saat içinde etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir. Hücrelerin enkapsülasyon öncesinde ve sonrasında rock inhibitörü ile işleme tabi tutulması gerektiğini unutmayın. Farklı indükleyiciler veya inhibitörler, gelecek deneyler için 3D diferansiyasyon protokolünü özelleştirmek amacıyla kullanılabilir.

İnsan ESL'lerini enkapsüle etmeye ve bunları 3D bir ortam altında farklılaştırmaya yönelik bu özel teknik, başta Parkinson hastalığı olmak üzere birçok hastalık için potansiyel hücre tedavisi amacıyla kullanılmaktadır.