Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Bu prosedürün genel amacı, doku kesitlerindeki iki ana DNA kırığı türünü işaretleyen çift etiketli bir DNA hasar sensörünün nasıl birleştirileceğini ve kullanılacağını göstermektir. Sensör, ZI ve Rumine ile çift etiketlenmiş 30 tümör DNA oligonükleotidi ile kendi kendine birleşen bir enzim olan vaccinia topoizomeraz bir veya vac topo'dan oluşur. VAC topo 30 tümöre bağlandığında, topo tanıma dizisinin üç asal ucundaki oligonükleotidi kestiğinde makine işlemi başlar ve bunun sonucunda vac topo ile aktive edilmiş bir fitzy etiketli birim ile amin etiketli serbest bir hairpin oluşur.

Terminal üç-prime hidroksil grubuna sahip olan üniteler kısa ömürlüdür ve hızlıca orijinal yapıya geri bağlanarakle ardından yeniden kesilirler. Ek moleküler DNA kırılmalarının yokluğunda, bu iki ünite sürekli olarak döngüsel bir şekilde ayrılır ve tekrar bağlanır. Moleküler sensör DNA hasarlı doku kesitlerine uygulandığında, Fitz etiketli detektör ünitesi beş-prime hidroksille sonlanan küt uçlu DNA kırılmalarına seçici olarak bağlanır.

R domine etiketli detektör ünitesi, beş prime fosfatlı küt uçlu bir kırılmaya bağlanacaktır. T dört DNA Ligaz mevcut olduğunda, floresan mikroskobisine dayalı olarak hücrelerdeki DNA'nın bir ve D'S iki tipi DNA kırıklarının varlığını ve dağılımını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, TUNEL gibi mevcut DSB tespit yöntemlerine göre temel avantajı, daha spesifik olması ve apoptozun hem otonom hem de fagositik fazlarını etiketleyerek ek bilgi sağlamasıdır.

Nanoteknoloji perspektifinden bakıldığında, sensör, gerçek biyolojik yapıları ve mimarileri toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların inşasına uyarlayan biyolojik tabanlı bir yaklaşımı örneklendirmektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü yöntemin başarısı, yüksek derecede aktif bir Toro SOM preparasyonunun kullanılmasına ve proteinaz K ile aşırı sindirimi önlemek için kesitlerin doğru şekilde işlenmesine bağlıdır. Bu prosedür için doku kesitleri, moleküler cihazın montajından önce hazırlanmalıdır. Paraldehit içerisinden kesilen beş ila altı mikron kalınlığındaki kesitler kullanılır.

Fikse edilmiş parafin gömülü doku bloklarının kullanılması önerilir. Doku kesitinin bulunduğu lamı bir lam rafına yerleştirin ve ksillende 15 dakika boyunca mumunu giderin. 15 dakika sonra, beş dakika daha taze bir ksillen banyosuna aktarın.

Lamı şu dereceli etanol konsantrasyonlarından geçirerek kesiti rehidrate edin. İki kez beşer dakika boyunca %96 etanol. Beş dakika boyunca %80 etanol ve ardından su.

Beşer dakikalık iki uygulama yapın. Rehidrasyondan sonra kesiti proteinaz K ile sindirin. Her kesit için 50 µg/mL konsantrasyonundaki çözeltiden 100 µL kullanarak, nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Doku tipine bağlı olarak sindirme süresinin ayarlanması gerekebilir; ancak aşırı sindirmeden kaçınmaya dikkat edin, çünkü sindirme tamamlandığında sinyal kaybına ve kesit bozulmasına neden olur.

Lamı, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez distile su ile durulayın. Ön bloklama için %2 BSA uygulayın ve nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, bu videoda bundan sonra gösterildiği gibi moleküler makineyi monte edin.

Moleküler makinenin montajı için gereken tüm reaktifler, ortalama büyüklükteki bir doku kesitinde tek bir saptama için yeterli olan toplam 25 microliter hacme göre ölçeklendirilmiştir. Hacim, gerektiğinde küçük plastik bir tüpte artırılabilir. Aşağıdaki reaktifleri, distile su ile belirtilen sırayla birleştirin.

%15 polietilen glikol 8,000, T4 DNA Ligaz tamponu, çift etiketli oligonükleotid vaccinia topoizomeraz I ve T4 DNA Ligaz pipetleme yoluyla nazikçe karıştırılır. Moleküler yapı bu solüsyonda neredeyse anında kendi kendine birleşecektir ve oda sıcaklığında hemen kullanılabilir. DNA kırılmalarının etiketlenmesi prosedürüne başlamak için, lam üzerindeki ön bloklama solüsyonunu aspire edin.

Her bölüme 25 µL tam reaksiyon karışımı uygulayın. Bölümün üzerine plastik bir lam kapatıcısı yerleştirin ve lamı nemlendirilmiş bir hazneye koyun. Hazneyi alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyonun ardından hem ligaz hem de topo sinyalleri gözlemlenebilse de, birçok durumda ligaz sinyali daha da artırılabilir. Sinyali güçlendirmek için, vac topo ve oligonükleotid bir içermeyen ancak oligonükleotid üç ve T dört DNA Ligaz içeren reaksiyon karışımını yeniden uygulayın, kesitin üzerine plastik bir lamel yerleştirin ve nemlendirilmiş bir hazne içerisinde 18 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında, lameli çıkarmak için lamı oda sıcaklığındaki su içeren bir coplan kavanozuna yavaşça dikey olarak daldırın.

Ardından kesiti üç kez, her biri 10 dakika boyunca distile su ile yıkayın. Kesiti sodyum bikarbonat tamponu ile durulayın. Bu alkali çözelti ile durulama işlemi, pH'a duyarlı olan ve yedi pH değerinin altında önemli ölçüde azalan fitzy floresansını artırır.

Son olarak, kesiti sayımlar için DPI içeren bir antifeiding solüsyonu ile örtün, çekirdekleri boyayın ve bir kapatma lamı uygulayın. Kesitler artık floresan mikroskobu için hazırdır. Bu şekilde, moleküler makinenin apoptotik süreçten geçen timik kortikal alanlarda DNA1 ve DNA2 tipi küt uçlu DNA kırılmalarını tespit ettiği, DNA2 tipi kırılmaları belirten yeşil sitoplazmik floresanlığın ve apoptotik timositlerin nükleer materyallerini sindiren kortikal makrofajların görüldüğü, dekzametazon ile işlem görmüş bir timus doku kesiti gösterilmektedir.

Bu sinyal vac topo tarafından üretilir ve beş prime hidroksil içeren DNA'ya sahip FGA lizozomlarında yerleşir. Çift zincir kırıkları, DNA'nın bir tip kırıklarını etiketleyen kırmızı floresan ile makrofajlar tarafından yutulmamış apoptotik timositlerin çekirdeklerini belirtir. Çok sayıda timosit eş zamanlı olarak apoptoza uğrar.

Ligaz tabanlı etiketleme ile görselleştirilen beş primer fosfat çift zincir kırığının oluşumuyla birlikte gerçekleşir. Bu kırıklar nükleer periferde yer alır ve halka şeklinde modeller oluşturur. Tüm hücresel çekirdekler, dpi ile karşı boyama yapılarak mavi renkte görselleştirilmiştir.

Bu prosedürü uygularken, farklı çözeltilerin eklenmesi arasında kesitlerin asla kurumasına izin verilmemesi gerektiğini unutmak önemlidir. Ayrıca tüm enzimatik preparatları, kesitlere eklemeden önce buz üzerinde tutun ve floresan problarınızı etiketleme reaksiyonu sonrası geliştirme aşamasında ışıktan koruyun. Bu teknik, heto hücre parçalanmasının tüm aşamalarının görselleştirilmesine olanak sağlamıştır.

Bu sensörün kendisi, nanoboyutlu partiküllerin, probların ve makinelerin tasarımına yönelik yeşil nanoteknoloji yaklaşımının bir örneğidir. Bu yaklaşım, yapay bileşenleri doğal olarak oluşan moleküler makine parçalarıyla birleştirir. Amaç, bu yüksek derecede dağılmış nanomalzemelerin toksisitesini ve olumsuz biyolojik reaktivitesini ortadan kaldırmaktır.