Numune Hazırlama

Bu prosedürün amacı, NMR metabolomikleri ile Mycobacterium tuberculosis hücreden arındırılmış ekstraktlarını analiz etmek için öncelikle kültürleme yapmak ve hücreleri uygun büyüme aşamasında hasat etmektir. Ardından hücreleri lizleterek analiz için hücreden arındırılmış ekstraktlar elde edilir. Liyofilize ekstraktlar, NMR analizi için tampon çözeltide yeniden süspande edilir.

Son olarak, NMR verilerini toplayın ve metabolitleri tanımlamak için spektra yazılımla analiz edin. Nihayetinde, mycobacterium tuberculosis'in NMR analizi, çeşitli tedaviler üzerine metabolit düzeylerindeki korunumları göstermek için kullanılır. NMR metabolomikleri, mycobacterium tuberculosis fizyolojisinin önemli metabolik yollar gibi temel yönlerine uygulanabilir.

Bu anlayış, ilaç etki ve direnç mekanizmalarını aydınlatmak ve ilaç tasarımı için yeni hedefler belirlemek açısından kritik öneme sahiptir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tüm örnekleri tamamen aynı şekilde işleme konusundaki yetersizlikleri nedeniyle zorlanabilirler; bu durum gereksiz varyasyonlara ve laboratuvarımdan kaynaklanan sonuçlara yol açacaktır. Doktora öğrencisi Steven Luka, NMR işlemleri için örneklerin nasıl hazırlanacağını gösterecektir. Laboratuvarımdan araştırma laboratuvarı yöneticisi ve üçüncü araştırma teknisyeni Robert Fenton, M tuberculosis ile çalışırken mycobacterium tuberculosis kültürlerinin nasıl işleneceğine dair prosedürleri göstereceklerdir.

Araştırma, kurumsal kılavuzlarca tanımlanan biyogüvenlik seviyesi üç uygulamalarını takip etmiştir. Biyogüvenlikle ilgili mülahazalar nedeniyle bu videodaki etiketlerde microbacterium tuberculosis yazmasına rağmen, bu gösterimde patojenik olmayan mycobacterium magmatic kullanılmıştır. M tuberculosis'in %50 gliserol stokunun buz üzerinde çözdürülmesiyle başlayın.

0,15 mililitreyi, 250 mililitrelik ER ve my flask içindeki 110 mililitre M-A-D-C-T-W broth'a inoküle edin ve kültürleri 37 °C'de, 100 RPM'de çalkalayarak yaklaşık altı gün boyunca büyütün. Antibiyotiklere, alternatif eklemelere veya diğer işlemlere ihtiyaç duyulursa, işlem gerektiren kültürleri hasat edin.

Kültür, titrasyon ve kalite kontrolü için buz üzerinde 0,5 mililitre Eloqua ayırın. Ardından istenen işlemi gerçekleştirin ve işlem süresi sona erdikten sonra kültürleri tekrar çalkalayıcıya yerleştirin. Bir mililitre numune alın ve OD 600 değerini belirleyin.

Ayrıca, kültür, titrasyon ve kalite kontrolü için 0,5 mililitre örneği ayırın. Kalan tüm protokol boyunca hücreleri buz üzerinde tutun. 15 mililitre buz gibi soğuk çift distile su ile yıkadıktan sonra hücreleri santrifüj ederek dört adet 50 mililitre tüpe hasat edin.

Pelletleri 10 mililitrelik alikotlarda süspande edin. İki alikot alın ve santrifügasyonla çöktürün, ardından hücre pelletini bir mililitrelik çift distile su ile son hacme tamamlayarak yeniden süspande edin. Topaklanma olmayan tek hücreli bir süspansiyon isteniyorsa, hücreleri 27 gauge iğneden geçirin.

Bir mililitrelik hücre süspansiyonunu, lizleme matrisi B içeren iki mililitrelik vidalı kapağa üç kez transfer edin. Fast Prep 24 lizleme homojenizatörünü biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin. Tutucu konuş plakasını sabitleyerek örnekleri örnek tutucuya yerleştirin. Ardından, saniyede altı metre hız ayarında 60 saniye boyunca işlem yapın.

Ardından, hücre kalıntılarını ve sağlam hücreleri çöktürmek için örnekleri santrifüjleyin. Daha sonra, canlı hücrelerin yokluğunu kontrol etmek amacıyla süpernatantı 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirerek steril bir tüpe aktarın. MADC.Agar üzerine 0,1 mililitre örnek ekleyin.

Numuneleri etanol içeren bir kuru buz banyosunda dondurun ve liyofilize edilip bir NMR tesisinde işlenmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. İki ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğunu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Eğer CFU saptanmazsa, numuneler daha ileri analizler için standart bir NMR tesisine taşınmak üzere BSL 3 laboratuvarından çıkarılabilir.

Numuneler kurutulduktan sonra 0,7 mililitre NMR tamponu ile yeniden süspande edin ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarıp 13.000 x g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. 0,6 mililitre numune alarak beş milimetrelik bir NMR tüpüne aktarın. Medya analizinden elde edilen, özel bir raf, birden fazla NMR tüpünün döndürücülere doğru derinlikte yerleştirilmesini kolaylaştırır.

Ardından, numuneleri A-B-A-C-S 20'li numune değiştiriciye yerleştirmek üzere NMR spektrometresine aktarın. İşlem görmemiş ve ilaçla işlenmiş kültürler arasında dönüşümlü olarak yerleştirme yapın. Otomatik bir çalıştırmanın başlangıcında ilk numunenin mıknatısa önceden yüklenmiş olması gerekir.

Cihazı kalibre etmek için, tek bir örnekle 90 derecelik darbe uzunluğunu optimize edin ve cihazı geri kalan örnekler için ayarlayın. NMR ve grad şim (grad shim) simgelerini kullanın. Her örnek için kilitleme, şimleme ve NMR veri toplama işlemlerini otomatikleştirin.

1D ¹H NMR spektrumu için, su baskılama ve uyarılma şekillendirme (excitation sculpting) içeren darbe dizisini seçin. İki boyutlu ¹H-¹³C HSQC spektrumu için toplam 32.000 veri noktası, 128 tarama ve 16 dummy tarama ayarlayın. Darbe dizisini seçin.

Doğrudan H 1 boyutu boyunca tarama genişliği ile toplam 2048 veri noktası ve dolaylı C 13 boyutu boyunca tarama genişliği ile 64 veri noktası seçin. Ayrıca, iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için 128 tarama ve 16 dummy tarama ile spektrum toplama işlemini belirleyin. M tuberculosis'ten elde edilen bir spektrum, 50 bilinen metabolit dahil olmak üzere yaklaşık 400 pik üretti.

Örneğin, ekli makalede ayrıntıları verilen veri işleme süreci, D alanin yolu ile doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili olan bu metabolit spektrumunu üretmiştir. Pik şiddetlerinin büyüklüğü, hücre özütünde bulunan metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır; bu nedenle, örnekler ve uygulamalar arasındaki metabolitlerdeki ve metabolik yollardaki göreceli sapmalar nicelendirilebilir. LMR metabolomikleri, bakteriyoloji alanındaki araştırmaların yolu açarak, görsel ve mikrobakteriler ile diğer patojenik veya patojenik olmayan mikroorganizmalarda fizyoloji ve patogenezi keşfetmelerine olanak sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, NMR metabolomikleri için birden fazla tüberküloz hücre ekstraktının nasıl hazırlanacağını ve güvenilir sonuçlar elde etmek için tüm protokol boyunca tutarlılığın nasıl korunacağını iyi bir şekilde kavramış olmanız gerekir.