Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik örneklerdeki nitrik oksit metabolitlerinin nasıl doğru ve spesifik bir şekilde tespit edileceğini göstermektir. Bu, öncelikle metabolit kaybını veya artefakt oluşumunu önlemek için kan örneklerinin toplama işleminin hemen ardından işlenmesiyle gerçekleştirilir. Eş zamanlı olarak, hipoksik bir ortamın nitrik oksit metabolitleri üzerindeki etkilerini minimize etmek amacıyla hızlı ve verimli bir doku hasadı yapılır.

Endotelyal fonksiyonlarını değerlendirmek amacıyla aort halkaları toplanır ve bir organ banyosuna asılır. Ayrıca, dokudaki nitrat seviyelerini, nitrit seviyelerini, nitrotiyollerin ve diğer nitroya doygun ürünlerin bağıl seviyelerini nicelleştirmek için biyokimyasal analizler kullanılır. Bu analizler kullanılarak, deney ve kontrol hayvanlarının uygun bir karşılaştırması, nitrik oksit üretimi ve metabolizması hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Bu çoklu sistem yaklaşımını tekil yöntemlere veya analizlere tercih etmenin temel avantajı, birden fazla organ sisteminde nitrik oksit biyokimyasının daha geniş bir tablosunun çizilmesine olanak tanımasıdır. Böylece, bu metabolitlerden hangilerinin prognostik veya tanısal fayda sağlayabileceğini ve nitrik oksit metabolit repertuvarının endotelyal nitrik oksit oluşumunu ve erişilebilirliğini nasıl yansıttığını anlamaya başlayabiliriz. Süreçteki her bir adım numunenin bütünlüğünü korumak açısından kritik olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi büyük önem taşımaktadır.

Örnek toplama ve doku ekstraksiyonunun çok detaylı olması nedeniyle, bu adımların bazıları tipik dergilerdeki yöntemler bölümü okunduğunda açıkça görülmez. Bu prosedürü laboratuvarımdaki kıdemli bir araştırma bilimcisi olan Dr. Hong Jing gösterecektir. Bu protokol için, dokuları da incelenecek olan deneysel hayvanlardan kan toplama işlemi yapılacak bir kişi veya deneysel hayvan hazır bulundurun.

İlk olarak, inferior vena cava'ya 25 gauge bir iğne yerleştirerek tam kan toplayın. 500 ila 1000 mikrolitre kan toplandıktan sonra, sol ventrikül apeksinden fizyolojik tampon infüze ederek hayvanı kalan kandan arındırın ve kan ile tampon inferior vena cava'dan çıkarken kanın tamamen yer değiştirmesini sağlayın. Venöz kan, toplama işleminden hemen sonra NEM ve EDTA içeren 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine alınmalıdır.

Santrifüj sonrası kanı 14.300 RCF'de yedi dakika boyunca döndürün. Plazmayı, RBC peletinden bir pipet yardımıyla aspire edin ve ayrı bir tüpe aktarın. İzole edilen plazma örneklerini HPLC için hazırlamak üzere, öncelikle 50 µL'lik plazma örneğine eşit hacimde soğuk metanol ekleyin.

Karışımı, bulanık görünüm alana kadar üç ila beş saniye boyunca şiddetle vorteksleyin. Ardından karışımı 14,300 RCF'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Plazma proteinlerini çöktürmek için süpernatantı ayrı bir 1,5 mililitrelik tüpe toplayın ve analiz edilene kadar dört derece Celsius'ta saklayın.

Kemilüminesans analizi için plazmayı hazırlamak amacıyla, yaklaşık 200 ila 400 mikrolitre olması gereken kalan plazma hacmini alın ve iki hacme bölün. Plazmanın bir yarısını, %10 hacim oranında %5 asitlendirilmiş sülfür ekleyerek ve 10 dakika bekleyerek hazırlayın. Bu örnek artık CLD analizi için hazırdır.

Beş dakika sonra %2'lik cıva klorürün %10 hacminde ekleyerek plazmanın diğer yarısını hazırlayın. Oda sıcaklığında, %10 hacminde asitlendirilmiş sulfonamid ekleyin. 10 dakika daha bekleyin ve bu örneği, plazmada olduğu gibi CLD'ye enjekte edin.

RBC peleti, her iki analiz için de HPLC ve CLD'ye hazırlanabilir. Bir birim hücre peletini dört birim hipotonik liziz çözeltisi ile karıştırarak başlayın. CLD analizi için karışımı vorteksleyerek iyice karıştırın.

Hücrelerin hazırlanması, plazma için uygulanan işlemle aynıdır. Eş hacimde metanol ekleyerek başlayın. Ardından, karışımı üç ila beş saniye boyunca kuvvetlice vortekslendirin ve ardından 14.300 RCF'de yedi dakika boyunca santrifüj edin.

Şimdi süpernatantı pipetle çekin ve nitrik oksit metabolitlerinin doku seviyelerini belirlemek için HPLC ile analiz edilene kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Deney hayvanlarının ilgili dokularında, önce kan toplanmalı ve önceki bölümde açıklandığı gibi hazırlanmalıdır; dokuların toplanması, dokuların hipoksik hale gelmemesi için hız ve verimliliğe özel dikkat gösterilerek her zamanki gibi yapılmalıdır. Toplanan doku örneklerini, N-E-M-E-D-T-A içeren PBS içerisinde bir beşe oranında homojenize edin.

Ardından, homojenize edilen dokuları RBC'ler için önceki bölümlerde açıklandığı şekilde HPLC ve CLD analizine hazırlayın. Yetişkin bir fareyi datil eter ile anestezi altına alıp ayak parmağı sıkıştırma yöntemine yanıt vermediğini doğruladıktan sonra torakotomi gerçekleştirin. Torasik ve abdominal boşlukları açığa çıkarmak için sternumdan pubis bölgesine kadar orta hat boyunca bir insizyon yapılır.

Ardından, hayvanı oksijenle zenginleştirilmiş Krebs Alite tamponu ile perfüze edin. Tamponu sol ventrikül apeksine enjekte etmek için 25 gauge bir şırınga kullanın. Kanın çıkışını sağlamak için sağ atriumu kesin.

Perfüzyondan sonra, karaciğeri, akciğerleri ve aortayı örtebilecek diğer dokuları kesip çıkararak abdominal aortayı izole edin. Ardından, kalbi bir pensle tutun ve aortayı hayvanın arka duvarından nazik bir şekilde kesin. Kalbi ve aortayı buzla dolu bir Petri kabına yerleştirin.

Kabın içine soğuk Krebs tamponu ekleyin. Aorttaki yağ ve adventisya tabakasını dikkatlice kesin ve temizleyin. Temizleme işlemi sırasında damar içindeki endotelyuma zarar vermekten kaçının.

Hipoksiyi önlemek için aortayı her beş dakikada bir taze buz soğukluğunda oksijenle doyurulmuş tampona aktararak metabolizmayı yavaş tutun. Şimdi bir skalpel kullanarak aortayı üç milimetre uzunluğunda halka şeklinde segmentlere kesin. Segmentleri, oksijenle doyurulmuş Krebs tamponu yüklü, dört kanallı 10 mililitrelik bir doku organ banyosuna aktarın.

Transduser düğmesini kullanarak her bir aortik halkaya 1,5 gram ön gerilim uygulayın. Ampirik bulgulara göre, optimal vazomotor fonksiyon için 1,5 gram uygun başlangıç gerilimidir.

Farede, sekiz kanallı oktal köprü ve veri toplama yazılımı kullanarak kuvvet ölçümünü izleyin ve kaydedin; halkaların 80 dakika boyunca dengelenmesine izin verin, bu sırada her 20 dakikada bir tamponu değiştirin ve ardından deney aşamasına geçin. Doku gerginliği dengeye ulaştıktan sonra, submaksimal kontraksiyon için her halkaya 100 nanomolar rezin veya fennel rine ekleyin. Halkadaki gerginlik stabilize olduğunda ve sabit bir ton seviyesi oluştuğunda, asetilkolin gibi bir endotelyal agoniste karşı doz-yanıt analizi gerçekleştirin.

Bu işlem, nitrik oksit üretimini ve damar gevşeme derecesini belirleyecektir. Asetilkolin doz yanıtı sonrası, banyoları Krebs tamponu ile durulayın ve damarları kasmak için her bir organ banyosuna 100 nanomolar rezene özütü ekleyin. Ardından, düz kas halkalarının, çözünür guanilil siklaz inhibitörü olan ODQ varlığında ve yokluğunda, sodyum nitroprusid gibi ekzojen bir nitrik oksit kaynağına karşı duyarlılığını belirleyin.

Bu yaklaşım türü, damarlar için %100 gevşeme değerini belirleyecek ve ayrıca vasküler gevşemeye karşı nitrik oksit yanıtının aracılanmasında çözünür guanilil siklazın temel rolünü ortaya koyacaktır. ODQ, asetilkoline yanıt olarak sodyum nitroprusid ile gerçekleşen gevşemeyi önleyeceğinden, sağlıklı kontrol farelerden alınan aort halkaları gevşerken, endotelyal disfonksiyonu olan farelerden alınan aort halkaları, nitrik oksit üretimindeki azalma nedeniyle azalmış gevşeme göstermiştir. Kontrol hayvanlarda nitrit kemilüminesansı yoluyla gruba özgü denitrasyon analizleri de gerçekleştirilmiştir.

RSNO ve RNNO, redüktif denitrozasyon analizi kullanılarak tespit edildi. Pik alanları çıkarılarak nitrit ve rSNO seviyeleri ölçüldü. Bu yöntem, bu nitrik oksit metabolitlerinin dolaşımdaki seviyelerinin doku seviyelerini nasıl yansıttığı ve farklı hastalık durumlarında metabolitlerin nasıl değiştiği gibi, nitrik oksit ve vasküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Çoklu organ sistemlerinde ve tek bir hayvanın dolaşımı boyunca bu ilgili nitrik oksit metabolitlerinin kararlı durum konsantrasyonlarının ve yarı ömürlerinin belirlenmesi, hastalık süreçlerinin spesifik moleküler imzalarının tanımlanmasına olanak sağlayacak ve klinisyenin hastalık şiddeti veya ilerlemesi için daha iyi biyobelirteçlerle donatılmasını sağlayacak yeni nitrik oksit tabanlı tedavi yöntemlerini tanımlamamıza yardımcı olacaktır. Genellikle, nitrik asit alanına yeni giren kişiler, biyolojik örneklerde bulunan bu düşük düzeydeki nitrik asit metabolitlerini saptamak ve nicelendirmek için birçok yöntemin yeterince hassas olmaması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Öncelikle, bu konuda deneyimi olmayan bir kişi, örnek işleme sırasında hatalı verilere ve verilerin yanlış yorumlanmasına yol açan artefaktlar oluşturma olasılığına sahiptir.