Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iyi tanımlanmış hasta kohortlarından elde edilen primer immün hücrelerin hücresel mekanizmalarını nicelendirmek için görüntü akış teknolojisinin kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle hastalardan veya sağlıklı gönüllülerden alınan kan örneklerinden periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İzolasyonun ardından hücreler aktive edilir ve ardından floresanla işaretlenir.

Ardından, hücreler hidrodinamik olarak odaklanır, lazer ışığı ile uyarılır ve zaman gecikmeli entegrasyonlu (TDI) bir CCD kamera ile görüntülenir. Son olarak, görüntü akışlı sitometresi kullanılarak görüntüler alınır ve NF kappa b miktarı belirlenir.

Her bir hücresel görüntüdeki translokasyon, ideas yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, her bir denek grubu arasındaki farklar nokta grafikleri, histogramlar ve hücre görüntülerinin analizi yoluyla belirlenebilir. Görüntü akışının avantajı, gerçekleri ve immünofloresansı birleştirmesidir.

Hücre sinyal yolaklarını, tek hücre veya popülasyon düzeyinde, soy hattına özgü bir şekilde ve yalnızca küçük bir kan örneğiyle başlayarak inceleyebiliyoruz. Bu yöntem, sinyal aracılarını lokalize ederek ve miktarını belirleyerek bilimsel bilgiye dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonun nasıl gerçekleştiğini araştırmak veya yaşlanmanın hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Laboratuvarımdaki birinci kıdemli araştırmacı, insan gönüllülerden elde edilen periferik kan mononükleer hücrelerini izole ettikten sonra tekniği uygulamalı olarak gösterecektir. Geri kazanılan pBمک'leri, 0,6 mililitre ortam başına 3 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve ardından hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Daha sonra, hücrelerin bir kısmını burada gösterilen TLR 8 agonist R848 gibi bir aktive edici ajanla stimüle edin ve ardından tüm hücreleri %5 karbondioksit inkübatöründe, 37 °C'de 10 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresinin ardından, hücreleri oda sıcaklığında 500 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin, süpernatantı atın ve hücreleri, kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılacak tek renkli konjugatlarla işaretlenmiş hücre tüpleri de dahil olmak üzere, monosit veya DC lineage'ları için spesifik yüzey antikorlarından oluşan bir kokteyl ile 4 °C'de 20 dakika boyunca işaretleyin. Ardından hücreleri oda sıcaklığında %4 P-F-A-P-B-S içinde 10 dakika boyunca fikse edin. Hücreleri oda sıcaklığında 500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, pbmc'leri dondurma tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri analiz gününe kadar -80 °C'de saklayın.

Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızlıca çözdürün ve ardından dondurma tamponunu uzaklaştırmak için santrifüjledikten sonra, 100 µL BD perm yıkama tamponu ile permeize edin. Ardından, burada gösterilen anti NF kappa BP 65 antikorları gibi hücre içi sinyalizasyon bileşeni karşıtı antikorlarla oda sıcaklığında 20 dakika boyunca etiketleyin. Hücreler pellet haline getirildikten sonra, onları keçi anti-tavşan IgG içeren 100 µL BD perm yıkama tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Alexa 647 ile boyayın ve PBMC'leri oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin. Görüntüleme işleminin hemen öncesinde hücreleri bir nükleer boya ile karşı boyamaya tabi tutun; ImageStream'e güç vererek ve ardından Inspire yazılımını başlatarak işleme başlayın. Ardından, varsayılan şablonu yükle (load default template) seçeneğine tıklayın ve ardından akışkan sistemini başlat (initialize fluidics) seçeneğini belirleyin.

Ardından görüntü galerisi menüsüne tıklayın ve tümünü seçin. Şimdi, boncukların görüntülemesine başlamak için kurulumu çalıştır'a basın ve ardından aydınlık alan kanalını seçin. Hız boncukları çalışmaya başladığında, cihazı kalibre etmek ve test etmek için yardım sekmesi altındaki tümünü başlat'a tıklayın.

ImageStream sistemi kalibre edildikten sonra, en parlak örneği makineye yüklemek için flush, lock and load düğmesine basın. Ardından, her bir florokromun nokta grafiklerinde ölçülen maksimum piksel değerinin 104.000 count arasında olacağı şekilde lazer gücünü ayarlayın. Daha sonra hücre sınıflandırma kriterlerini belirleyin.

Şimdi çalıştır (run) düğmesine tıklayın, deney veri dosyasını toplamak ve kaydetmek için veri toplama (acquire) işlemini gerçekleştirin. Veri dosyalarını analiz etmek için öncelikle analiz yazılımını açın. Kompanse edilmiş görüntü dosyaları oluşturun ve ardından normal nükleer boya yoğunluğuna ve yüksek nükleer boya en-boy oranına sahip olayları kapılayın (gate). R1 kapısındaki tek hücreleri kalıntılardan veya çok hücreli olaylardan ayırt etmek için; monositler CD14 pozitif hücreler kapısında, CD11c değeri yüksek, CD4 ve lin1 markerları değeri düşük olan myeloid dendritik hücreler ise R3 kapısında bulunur.

Son olarak, sitoplazmik transkripsiyon faktörü NF kappa B'nin nükleer boya ile kolokalizasyonunu belirlemek için ideas yazılımını kullanın. NF kappa B ile nükleer boya arasındaki yüksek korelasyon, iki markörün kolokalizasyonuna işaret eder, yüksek bir benzerlik puanı ile yansıtılır ve hücrenin aktivasyon derecesini gösterir. Farklı tedavi grupları veya hasta popülasyonları arasındaki yüksek benzerlik olaylarının yüzdesi, hücrelerin göreceli fonksiyonel etkinliğini değerlendirmek için karşılaştırılabilir.

Ardından, popülasyon histogramlarının kilit segmentlerinden hücre görüntülerini görüntülemek için yazılım kullanılabilir. ImageStream, hücre alt kümelerinin doğrudan pbmc üzerinden kapılanmasına (gating) ve kaplanmış ancak sıralanmamış hücre popülasyonlarından hücre yanıtlarının görüntülenmesine olanak tanır. Burada, TLR sinyallemesinin lin one, negatif CD four, dim CD 11 C pozitif miyeloid dcs hücrelerinde NF kappa BP 65'in nükleer lokalizasyonu üzerindeki etkisi bazal düzeyde nicelendirilmiştir.

Sitoplazmasında transkripsiyon faktörü NF kappa BP 65 bulunan uyarılmamış hücrelerin yüksek bir yüzdesi gözlemlenmiştir. Stimülasyon sonrası, işlem görmüş hücrelerin NF Kappa BP 65 ile nükleer boya PI arasında anlamlı düzeyde daha yüksek bir benzerlik skoruna sahip olduğu belirlenmiş, bu durum NF Kappa BP 65'in stimülasyon sonrası çekirdeğe transloke olduğunu göstermiştir. İşlem görmemiş veya R 8 48 ile stimüle edilmiş hücre popülasyonlarından eş zamanlı olarak toplanan dijital görüntüler, temsili hücreleri ve hücre çekirdeğine transloke olan NF kappa B yoğunluğunu göstermektedir. R 8 48 ile stimüle edilen gruptaki NF Kappa B ve PI boyamasının, işlem görmemiş hücrelere kıyasla daha parlak yoğunluğa sahip olduğuna dikkat ediniz.

Bu tekniği farklı yaşlardaki donörlerden alınan hücreler üzerinde kullandık ve TLR aracılı NF kappa B aktivasyon yollarında farklılıklar olduğunu gösterdik. Uzmanlaşıldığında, bu teknik, görüntü analizi için gereken ek süreye ek olarak bir gün içinde tamamlanabilir ve hem birçok lokalizasyon görüntüsünün hem de popülasyon istatistiklerinin elde edilmesine olanak tanır. Ayrıca, fiziksel ayırma işlemi yapmadan doğrudan birden fazla hücre popülasyonundan gelen yanıtları görüntüleyebiliriz. Görüntü akışı, bir dizi hücresel mekanizmaya geniş çapta uygulanabilir ve translasyonel araştırmalarda oldukça değerli olacaktır.