TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem

Bu prosedürün amacı, doğal transformasyon ve flip kombinasyonuna dayanan bu hızlı ve verimli yöntemle vio cray'i genetik olarak manipüle etmektir. Bu işlem, öncelikle transformasyonun doğal indükleyicisi olan uygun bir kitin kaynağı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, iki tur PCR kullanılarak bir DNA konstrüktü oluşturulur ve ardından doğal transformasyon uygulanır; böylece PBR flip plazmidi içeren bakterilerin PCR fragmanını alması ve bunu genomlarına entegre etmesi sağlanır.

Ardından, flip rekombinasyon hedefinin veya FRT bölgesiyle çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetinin uzaklaştırılması için plazmit tarafından kodlanan lipaz enzimini indüklemek amacıyla sıcaklık artışı uygulanır. Son adımda, bakteriler FLP kodlayan plazmitten arındırılır. Nihayetinde, genetik manipülasyonun başarılı olduğunu göstermek için PCR ve sekanslama kullanılır.

Bu tekniğin, intihar plazmidleri kullanarak virüsleri genetik olarak manipüle etmek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça hızlı ve verimli olmasıdır. Standart 1,5 mililitrelik plastik tüplere 50 ila 80 miligram kitin pulu örnekleri tartarak başlayın, ardından tüplerin kapaklarını açık tutarak pulları otoklavlayın; otoklav işlemi biter bitmez kapakları hemen kapatın ve otoklav kitini oda sıcaklığında saklayın. İlgi duyulan DNA bölgelerinin yanı sıra FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini PCR ile çoğaltmak için en az altı oligonükleotid gereklidir. Ayrıca, eklenen PCR fragmanının dış kısmına bir çift oligonükleotid primeri eklenmesi önerilir.

Bu durum, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik direnç kaseti tasarımının entegrasyonunun ve doğru eksize edildiğinin kontrol edilmesine olanak tanır; iki, üç, dört ve beş numaralı oligonükleotidler dikkatle hazırlanmalıdır. Genomik DNA'ya yeterince bağlanabilmeleri için iki ve beş numaralı primerler en az 28 baz çifti içermelidir. Üç ve dört numaralı primerler, kalıp olarak FRT içeren bir plazmid ile yapılandırılmalıdır; iki ve üç numaralı primerler ile dört ve beş numaralı primerlerin beş prime uçlarında kapsamlı tamamlayıcı baz eşleşmesine izin verecek şekilde iki ve beş numaralı primerleri tasarlayın.

Şimdi ilk PCR turu için, özel tasarlanmış konstrüktlerin ilgilenilen deneysel bölgesinin yukarı akış (upstream) bölgesini amplifiye etmek amacıyla, eş zamanlı ancak bağımsız yürütülecek üç PCR reaksiyonunun birincisini hazırlamak için birinci ve ikinci oligonükleotidleri kullanın. Paralel olarak, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini amplifiye etmek için üçüncü ve dördüncü oligonükleotidleri kullanarak ikinci PCR reaksiyonunu hazırlayın. Örneğin bu deneyde, kanamisin direncini kodlayan A PH geni kullanılmıştır.

Oligonükleotid beş ve altı ile genomik DNA'yı kalıp olarak kullanarak üçüncü PCR reaksiyonunu hazırlayarak aşağı akış DNA bölgesini eş zamanlı olarak amplifiye edin. Daha sonra, her üç PCR fragmentinin saflaştırılmasının ardından üç örnek için de PCR reaksiyonunu başlatın; birinci turda elde edilen üç fragmentin eşit miktarlarda karışımını, ikinci tur PCR'ı gerçekleştirmek için kalıp olarak kullanın. Bu amplifikasyon, oligonükleotid bir ve altı tarafından katalize edilecektir.

Elde edilen PCR fragmanı, doğal transformasyon deneylerinde transforme edici DNA olarak kullanılacaktır. v cholera hücrelerini, 30 °C'de aerobik olarak zenginleştirilmiş besiyerinde büyüttükten sonra, bakterileri oda sıcaklığında santrifügasyon ile hasat edin.

Ardından, bakteri kültürünü pul halindeki kitine aktarın ve hücre süspansiyonunu 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, ikinci tur PCR ile elde edilen fragmanlardan en az 200 ng'ı bakteri hücre süspansiyonuna dikkatlice karıştırın. Bakterilerin kitin yüzeylerinden aşırı derecede ayrılmamasına dikkat ederek, bu çözeltiyi 30 °C'de, hareket ettirmeden bir gün daha inkübe edin.

Şimdi, PBR flip plazmidini taşıyan bakteriler için kültürü en az 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin; ardından hücre çözeltisinin 100 ila 300 µL'sini, ampicillin içeren çift seçici plakalara yayın. Plakalardaki diğer antibiyotiğe ek olarak, bakteri hücre kültürlerini koloniler görünene kadar 30 °C'de inkübe edin. Ardından, seçici plakalardan tekil transformantları izole edin.

Bu adıma, bakterileri ampicillin içeren LB agar plaklarında 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyüterek başlayın. İsteğe bağlı bir adım olarak, PBR flip plazmidinden flip ekspresyonu daha yüksek sıcaklıklarda dereprese olduğu için sıcaklığı iki ila üç saat boyunca 40 °C'ye çıkarın. 37 °C'de sekiz saatlik ek inkübasyonun ardından bakterileri taze plakalara aktarın.

Şimdi, antibiyotik duyarlılığını test etmek için klonları antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarında paralel olarak kısıtlayın ve ardından ortaya çıkan tek bir antibiyotik duyarlı koloniyi izole edin. Bu adıma, kültürü aerobik koşullar altında 30 °C'de, antibiyotiksiz zenginleştirme besiyerinde gece boyunca büyüterek başlayın. Ertesi sabah, gece boyunca büyütülen kültürü taze antibiyotiksiz besiyerinde 1:100 oranında seyrelterek üç ila altı saat boyunca yeni bir kültür büyütün; öğleden sonra kültür seyreltisini düz LB agar plaklarına ekim yapın veya plaklayın ve ardından koloniler görünür hale gelene kadar plakları 30 °C'de sekiz ila 16 saat daha inkübe edin.

Komşu genler olan CTXA ve CTXB'nin silinmesini amaçlayan bu ilk deneyde, trans flip yöntemi için gerekli oligonükleotidler daha önce gösterildiği gibi oluşturulmuştur. Ebeveyn suş, C-T-X-A-B'nin orijinal DNA lokusu yerine FRT bölgeleriyle çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetini taşıyan ara suş ve C-T-X-A-B'nin silindiği ve direnç kasetinden arındırıldığı final suşun genotiplerinin tamamı test edilmiştir. Bu deney için, transforme eden PCR fragmanına değil, yalnızca kromozomal DNA'ya bağlanan primerler kullanılarak kapsamlı PCR gerçekleştirilmiştir. PCR fragmanlarının boyutlarını belirlemek için standart agaroz elektroforezi ile ayırma işlemi yapılmıştır.

Birinci şeritte, dünya tipi B kolera suşu 3.143 baz çifti beklenen fragman boyutunda yer almıştır. İkinci şeritte, delta C-T-X-A-B-F-R-T suşundan türetilen PCR fragmanı 3.162 baz çiftinde yer almıştır.

Üçüncü kanalda ise, delta ctx A B FFR TP CR fragmanı, 1 KB merdiven ile karşılaştırıldığında 1.769 baz çiftinde yer almıştır. Tüm bir genomik adanın çıkarıldığı ikinci örnekte, bu deney için hedef olarak Vibrio Patojenite adası bir veya VPI bir seçilmiştir. Trans-flip yöntemi iki adımda modifiye edilmiştir.

İlk olarak, kanamisin direnç geninin entegrasyonu, PI bir'in başlangıcındaki tek bir FRT bölgesi ile gerçekleştirilmiştir. Ardından, patojenite adasının sonundaki ikinci bir FRT bölgesini takiben Gentamisin direnci şeklinde ek bir antibiyotik direnç belirtecinin eklenmesine olanak tanıyan ikinci bir doğal transformasyon turu uygulanmıştır. İlgili primer çiftleri her jel görüntüsünün üzerinde belirtilmiştir ve trans FLP yöntemine az önce gösterildiği şekilde devam edilmiştir.

Ebeveyn, ara ve final suşlarının tamamı, birinci şeritteki saflaştırılmış genomik DNA'nın PCR'ı ile doğrulandı. Vahşi tip V cholera suşunun PCR fragmanı ikinci şeritte çalıştırıldı. VPI one FRT can GM FRT suşundan elde edilen PCR fragmanı çalıştırıldı.

Üçüncü şeritte ise delta VPI bir FRT türevli PCR ürünü analiz edilmiştir. Primer çiftleri her jel görüntüsünün üzerinde belirtilmiştir. Nihai suş, VPI bir'in tamamından yoksundur.

Bu üçüncü örnekte, standart protokolden hafif bir modifikasyonla trans flip yöntemi kullanılarak, doğal transformasyonun ana düzenleyicisi olan Gene T fox'un yukarı akımına bir T seven RNA polimeraz bağımlı promotor dizisi entegre edilmiştir. T seven RNA bağımlı promotor konsensüs dizisi, bu DNA dizisinin kromozom içinde korunması amacıyla dört ve beş numaralı oligonükleotidlere sarkıntı (overhang) olarak eklenmiştir. Antibiyotik direnç kaseti eksize edildikten sonra, konstrükt T seven RNA polimeraz içeren bir V colorized suşa entegre edilmiştir.

Bu suşta, T7 RNA polimeraz bağımlı T-Fox ekspresyonunu test etmek için T7 RNA polimeraz geni ekspresyonu LAC UV5 promotörü ile yönlendirilmiştir. Doğal transformasyon deneyleri LB ortamında gerçekleştirilmiştir. T-Fox genini önceden takip eden T7 bağımlı promotörden yoksun olan ebeveyn suş; zengin ortamda T-FOX transkripsiyonunun gerçekleşmemesi ve doğal indükleyici kitinin yokluğu nedeniyle bu koşullar altında doğal olarak transforme edilemez. Bu fenotip, T7 RNA polimerazın IPTG ile yapay olarak indüklenip indüklenmediğinden bağımsızdır.

Buna rağmen, kompetans geni T Fox'un yukarısında T7 RNA polimeraz bağımlı promotör içeren trans flip ile oluşturulan suş, LB medyumundaki LAC UV five promotörünün sızıntısı nedeniyle zenginleştirilmiş medyumda gerçekten doğal olarak transformablé idi. Üretilen T7 RNA polimeraz, IPTG ile indüksiyon olmadan T7 RNA polimeraz bağımlı promotörden T FOX'u zaten transkribe etmişti. Bu durum, entegre edilen T7 RNA polimeraz bağımlı promotör dizisinin işlevselliğini doğrulayarak doğal kompetansı ve transformasyonu başlatmıştır.

Bu fenotip, LAC UV beş promotörünün indükleyicisi olan IPTG'nin eklenmesi sayesinde T seven RNA polimerazın tam indüksiyonu ile önemli ölçüde artırılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kitin indüklemeli doğal transformasyon ve flip rekombinasyon kombinasyonunu kullanarak V. cholera'nın genetik olarak nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında bu teknik, yalnızca birkaç gün içinde genlerin veya genomik adaların silinmesine ve ayrıca DNA dizilerinin bölge yönelimli bir şekilde entegre edilmesine olanak tanır.