Radyoaktif In situ Hibridizasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gen fonksiyonunun anlaşılmasına katkıda bulunmak için belirli gen ekspresyon bölgelerini belirlemek ve gen ekspresyonunun zamanlamasını ve seviyelerini karakterize etmektir. Bu, doku bütünlüğünü korumak amacıyla, prosedürde kullanılacak dokunun hızlıca hasat edilmesi ve hazırlanmasıyla sağlanır. İkinci bir adım olarak, ribo probların arka plan bağlanmasını azaltmak için dokuya işlem uygulanır.

Ardından, ribo probları doku ile hibritlenir ve RIBA probunun bağlanması görselleştirilir. X-ray filmi veya ışığa duyarlı emülsiyon kullanılarak, x-ray görüntüleri veya karanlık ve parlak alan mikroskobu ile analizlere dayalı olarak gen ekspresyonunun konumunu ve seviyesini gösteren sonuçlar elde edilir. Image J yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen süreçte, birçok kişinin hata yaptığı ve iyi yapılması gereken birkaç kritik adım bulunmaktadır; bunlardan biri de arka plan gürültüsünü önlemektir.

Kötü doyurma veya uygun sıcaklıkta hibridizasyon yapmama gibi arka plan gürültüsüne neden olabilecek bir dizi adım vardır. Bir diğeri ise RNA probunuzu degrade edecek olan RNA kontaminasyonudur. Bu nedenle, her şeyi RNA'dan arındırılmış tutma konusunda dikkatli olmalısınız.

Üçüncü olarak, lamlar emülsiyona daldırıldığında, karanlık odanızda herhangi bir ışık sızıntısı olmadığından veya üç hafta sürebilen bu sürecin tüm aşamalarında emülsiyonun ışığa maruz kalmadığından emin olmanız gerekir. Bu tekniği, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Hun Chen uygulamalı olarak gösterecek. Taze bir beyin hasat edilip 1x PBS ile durulandıktan sonra, beyni oda sıcaklığında medya içeren bir kalıba daldırarak OCT doku teknik medyasına gömün.

Beynin kesit alma işlemi için gerektiği şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Ardından, kuru buzun üzerine etanol püskürttükten sonra, bloğu etanol ve kuru buz karışımına yerleştirerek dokuyu dondurun. Etanolün bloğun içine girmemesine dikkat ederek, bir kriyostat yardımıyla donmuş dokuyu 10 ila 12 mikron kalınlığında kesitler halinde dilimleyin ve beyin ile embriyonik dokular için uygun olan super plus lameller üzerine monte edin.

En iyi kesme sıcaklığı -18 °C ile -20 °C aralığındadır. Kesitleri -80 °C'de bir lam kutusunda saklayın. Lamları -80 °C depolama alanından kuru buz üzerindeki bir metal rafa aktarın.

Ardından, sertifikalı bir çeker ocak içerisinde çalışırken, rafı oda sıcaklığının üç ila beş derece üzerine önceden ısıtılmış %4'lük paraformaldehit çözeltisine yerleştirin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından rafı paraformaldehitten çıkarın ve rafı PBS içine 15 kez daldırarak lamları yıkayın. Bu yıkama adımını, her seferinde taze PBS çözeltisi kullanarak iki kez tekrarlayın.

Ardından, RIBA probunun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları taze hazırlanmış asetilasyon tamponu içerisinde 10 dakika bekletin. Sonra lamları daha önce yaptığınız gibi yıkayın, ancak bu kez yıkama solüsyonu olarak 2x SSPE kullanın. Dokuyu, her bir solüsyonda iki dakika kalacak şekilde %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ileyerekdehidre edin.

Ardından slaytları çeker ocakta en az 10 ila 15 dakika boyunca kurutun. Yazılı protokoldaki talimatlara göre RIBA probunu sentezledikten sonra, tüm slaytlar için gerekli olan RIBA probu ve hibridizasyon çözeltisi hacmini hesaplayın. Ribo prob hibridizasyon karışımını beş dakika boyunca 65 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun.

Ribo probu denatüre etmek için 100 µL Ribo probu hibridizasyon solüsyonu pipetleyerek lam üzerine yayın. Ardından, solüsyonu doku ve lam üzerine eşit şekilde yaymak için ikinci bir lam kullanın. Lamı yatay ve yüzü yukarı bakacak şekilde bir metal rafa yerleştirin ve tüm lamlar hazır olduğunda, rafı yavaşça 65 °C'lik bir yağ banyosuna minimum dört saat ve maksimum 16 saat süreyle daldırın.

Yağ, inkübasyonun ardından lamel çevresinde hava sızdırmaz bir mühür oluşturur; lamları içeren metal raftaki fazla yağı temizleyin. Ardından, çeker ocak içerisinde kloroform içeren cam veya metal bir tepsiye rafı yerleştirin. Yıkama işlemini, taze kloroform içeren ikinci bir tepsiyle tekrarlayın.

Ardından, lamelleri gevşetmek ve fazla hibridizasyon çözeltisini çözmek için rafı %0,1 beta-merkaptoetanol artı 2x SSPE çözeltisine daldırın. Daha sonra lamları, taze %0,1 beta-merkaptoetanol artı 2x SSPE çözeltisinden oluşan ikinci bir çözeltiye aktarın. Lamelleri çıkarılmış lamları, bağlanmamış fazla RNA probunu uzaklaştırmak amacıyla oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilmek üzere, %0,1 beta-merkaptoetanol içeren 2x SSPE çözeltisi bulunan bir tepsideki taze bir rafa aktarın.

Ardından, lamların bulunduğu kaseti, 65 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş, final konsantrasyonu %0,1 beta ME içeren 2x SSPE artı %50 ana geniş çözeltiye aktarın ve 65 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bu çözeltiyi ve önceki tüm sulu yıkama çözeltileri ile lamelleri radyoaktif atık olarak bertaraf edin. Sonrasında, lamları 65 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş 0,1x SSPE içerisinde, her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.

Ardından dokuyu, her bir çözeltide iki dakika boyunca %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ilele dehidre edin. Son olarak lamları bir çeker ocakta en az 30 dakika boyunca kurutun. İlk olarak, dokuda radyoaktif bir sinyalin mevcut olup olmadığını belirleyin.

Kurutulmuş lamları, güvenli ışık kullanılan karanlık bir odada çalışarak bir film kasetine yerleştirin ve lamların üzerine röntgen filmi koyun. Lamların filmin emülsiyon tarafına baktığından emin olun ve ardından kaseti kapatın. Transkriptlerin beklenen bolluğuna bağlı olarak, lamları bir ila yedi gün boyunca filme maruz bırakın.

Pozlama tamamlandıktan sonra, röntgen filmini standart geliştirici ve sabitleyicide geliştirin. Hibritleme sinyali, hücresel çözünürlüğü belirlemek ve sinyali dokunun üzerinde görmek için emülsiyondaki pozlanmış gümüş taneciklerinden kaynaklanan siyah alanlar şeklinde filmde görünecektir. Lamlar fotoğraf emülsiyonuna daldırılır ve ardından karşı boyama yapılır.

Slaytlar kristal viyole ile karşıt boyanacaksa, kesitler yazılı protokoldeki talimatlara göre dilikize edilmelidir. Bu aşamada, karanlık odada çalışarak bir tüpe distile su doldurun. Bir miktar NTB emülsiyonu alın ve emülsiyonu distile su ile bire bir oranda seyreltin.

Emülsiyonu 42 °C'lik bir su banyosunda 20 ila 30 dakika boyunca erittikten sonra, 42 °C'lik su banyosundaki cam daldırma kabına aktarın. Seyreltilmiş emülsiyon seviyesi, lam daldırıldığında lam üzerindeki tüm kesitleri kapatacak düzeyde olmalıdır. Çok sayıda lam varsa, ekstra emülsiyona ihtiyaç duyulabilir.

Şimdi lamları, 42 °C'lik bir su banyosundaki seyreltilmiş emülsiyona daldırın ve ardından daldırılan lamları karanlık odada kapalı, ışık geçirmeyen bir kapta gece boyunca veya bir fırında ışıklar kapalıyken 37 °C'de iki ila üç saat boyunca kurutun. Kurutma işleminden sonra lamları bir lam kutusuna aktarın. Kenarları siyah elektrik bandı ile mühürleyin ve ardından alüminyum folyo ile kaplayın.

Kutuları birkaç gün veya hafta boyunca dört derece Celsius'ta saklayın; geliştirme aşamasına gelindiğinde lamları oda sıcaklığına getirin. Ardından, karanlık odada çalışırken, lamları içeren rafı kutulardan çıkarın ve 16 derece Celsius'ta üç ila beş dakika boyunca codec D 19 geliştirici ile geliştirin. Sonrasında, geliştirilmiş lamları oda sıcaklığındaki musluk suyunda bir dakika boyunca yıkayın.

Ardından lamları, 19 °C'de altışar dakika süreyle iki kez tespit çözeltisinde inkübe edin; ikinci tespit inkübasyonu sırasında oda ışıkları açılabilir. Şimdi lamları oda sıcaklığında akan su altında en az 30 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra bir jilet kullanarak, lam hâlâ ıslakken arka yüzündeki emülsiyonu kazıyın.

Son olarak, %0,3 kristal viyole ile karşı boyama yapın, ardından gerekirse yazılı protokoldeki talimatlara göre lamları susuzlaştırıp kapatın. Lamların arkasındaki fazla emülsiyonu, suyla ıslatıp bir jiletle kazıyarak temizleyin. Lamları %80 etanol çözeltisinde durulayın ve kalıntılardan ve tozdan kurtulmak için bir veya iki kez nazikçe silin.

Karanlık alan veya parlak alan aydınlatması altında fotoğraflar çekin. Toz partikülleri, bir diseksiyon mikroskobu altında karanlık alanda kolayca görülebildiği için, tozsuz kaliteli görüntüler elde etmek amacıyla kazıma ve temizleme adımlarının iki ila üç kez tekrarlanması gerekebilir. Aşağıdaki görüntüler, röntgen filmlerinden elde edilen in situ hibridizasyon otoradyografisi örnekleridir.

Bu röntgen filmi görüntüsü, Fox P1'e karşı antisens ribo prob ile hibridize edilmiş, embriyonik 10. gündeki zebra ispinoz şarkı kuşunun sagital tüm baş kesitini göstermektedir. Film üzerindeki siyah pozlanmış tanecikler, beyin içinde görülebildiği üzere haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir; burada Fox P1 haberci RNA, mesoalium striatum ve dorsal talamusta zenginleşmiştir. Röntgen filmi görüntüsü, Cuper'e karşı antisens RIBA prob ile hibridize edilmiş aynı zebra ispinoz şarkı kuşundan alınan bir kesiti göstermektedir.

TF iki Co.TF iki, palam alium ve daha ventral talamus ihtiyacında zengindir. Aşağıdaki görüntüler, emülsiyon daldırma lamlarından alınan in situ hibridizasyon otoraidiyografisi örnekleridir. Bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen bu karanlık alan görüntüsü, Fox P bir'e karşı antisens RIBA probu ile hibridize edilmiş, kuluçka sonrası altıncı gündeki zebra ispinozunun sagital tüm baş kesitini göstermektedir.

Dokunun üzerindeki emülsiyonda bulunan beyaz açık gümüş granülleri, haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir. Kırmızı renk, kressel violet boyasını temsil etmektedir. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil eder.

Buradaki görüntü, antisense ribo probu ile coop TF two için hibridize edilmiş aynı zebra ispinoz şarkı kuşundan alınan bir kesiti göstermektedir. Aşağıdaki görüntüler, embriyonik 12. gündeki zebra ispinozundan alınan sagittal kafa kesitlerinin röntgen filmleri üzerindeki otoradiografisinde farklı kalıplar sergileyen antisense ve sense işaretlemelerini karşılaştırmaktadır. Kesik çizgi tüm beynin konturunu, C ise serebellumu belirtmektedir.

PAC altı'nın antisens sarmalının beyinde, özellikle ventriküler bölgede eksprese olduğu görülmektedir. Pak altı'nın sens sarmalı ile hibridize edilen komşu kesitte, embriyo başı boyunca herhangi bir arka plan ekspresyonu görülmezken, antisens sarmalda olduğu gibi retinanın pigment tabakasında belirgin bir ekspresyon görülmektedir. Aşağıdaki görüntüler, zebra ispinozu beyninin geç embriyonik evrelerinden alınan, parlak alan ve karanlık alan görünümleri altındaki iki gen ekspresyon sinyalini ve emülsiyon daldırma lamlarını göstermektedir.

Bu aydınlık alan görüntüsü, embriyonik 10. gündeki D one B ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona yapılan normal bir pozlamada, siyah görünen etiket bu büyütmede zar zor seçilebilmektedir. Bu görüntü, önceki görüntüdeki ile aynı kesit ve büyütmeyi göstermektedir ancak karanlık alan görünümüne geçilmiş olup striatum ve talamustaki etiketlemeler beyaz renkte görülmektedir.

Bu aydınlık alan görüntüsü, embriyonik 12. gündeki slit three ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona aşırı pozlama yapıldıktan sonra, siyah etiket kolayca görülebilir. SC omuriliğin konumunu, CB ise serebellumun konumunu belirtmektedir.

Rostral yön sola doğrudur. Burada gösterilen görüntü aynı kesittir ve büyütme aynıdır; ancak parlak alan görüntüsüyle eşleşen spinal korddaki beyaz işaretlemeleri gösteren karanlık alan görünümüne geçilmiştir. İlerideki görüntüler, hücresel düzeydeki gümüş tane çözünürlüğünü göstermektedir.

Burada zebra ispinozunun ön beynindeki Fox P1 haberci RNA işaretlemesi gösterilmiştir; gümüş tanecikleri, kristal viyole ile boyanmış hücrelerin üzerinde siyah noktalar şeklinde görünmektedir. Bu görüntü, yetişkin zebra ispinozu mesoalium bölgesindeki münferit hücrelerde yüksek düzeyde ekspresyonu göstermektedir. Bu görüntü ise aynı kesitteki komşu alium bölgesindeki münferit hücrelerde düşük düzeyde ekspresyonu göstermektedir.

Hi Fox. P one haberci RNA ekspresyonu, embriyonik 12. gün mezalyumunda hücreler üzerinde görülmektedir.

Burada görülen embriyonik hücreler, önceki iki görüntüde görülen yetişkin hücrelere kıyasla daha küçük ve daha sıkı yerleşimlidir. Son olarak, bu görüntü aynı kesitin bitişik aliumundaki hücreler üzerinde düşük düzeyde ekspresyon göstermektedir. Bu prosedür uygulandıktan sonra, hedef genin hangi hücre tipinde eksprese olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla immünokimya gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kurum hibridizasyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür sırasında kişisel koruyucu ekipmanlar gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.