Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, insan plazmasında fibrin pıhtısının oluşumu sırasında bir koagülasyon protein faktörü olan faktör V'nin aktivitesini ölçen bir mikroplaka analizi geliştirmektir. Yaralanmaya yanıt olarak kan koagülasyon süreci aktive olur ve nihayetinde pıhtılaşma enzimi trombinin üretilmesine yol açan bir dizi zymojen-proteaz dönüşüm reaksiyonu ile sonuçlanır; trombin, çözünür fibrinojeni, daha sonra birleşerek çözünmez bir fibrin pıhtısı oluşturacak olan fibrin monomerlerine parçalar. Normal şartlarda, sağlıklı veya yaralanmamış durumda kan serbestçe akan bir sıvı olarak kalır ve oluşan fibrin miktarı, degrade olan veya parçalanan fibrin miktarına eşittir.

Ancak, belirli hastalık durumlarında, aşırı pıhtılaşma kalp hastalığına ve inmeye yol açarken; yetersiz pıhtılaşma, hemofililerde sıklıkla görüldüğü üzere kanama eğilimlerine yol açar. Faktör V, plazmada bulunan bir proteindir ve aktive formu olan faktör beş A, prothrombin enzim kompleksinin bir parçası olarak fibrin pıhtısı oluşumu sırasında trombin üretiminin kritik bir hızlandırıcısıdır; prothrombin; faktör 10 A, proteaz faktör beş A, ko-faktör lipid, yüzey ve kalsiyum olmak üzere dört bileşenden oluşur. Faktör beş A, faktör 10 A'nın substratı prothrombin'e karşı katalitik verimliliğini veya kcat değerini yaklaşık 3000 kat artırarak, böylece trombin üretimini ve fibrin pıhtısı oluşumunu önemli ölçüde güçlendirir.

Mikroplaka platformu; kullanım kolaylığı, zaman maliyeti, düşük örnek hacimleri, sürekli izleme ve yüksek verimlilik nedeniyle enzim katalizli olayların ölçümünde tercih edilmektedir. Fibrin pıhtısı oluşum olayı, plazmanın ışık absorbansındaki artışın bir mikroplaka okuyucu ile ölçülmesiyle izlenebilir; bu süreçte plazma, fibrin pıhtısının bulunmadığı ve minimum ışık absorbansına sahip berrak sarı bir görünümden, fibrin pıhtısının bulunduğu ve maksimum ışık absorbansına sahip opak bulanık bir görünüme dönüşür. Bu tekniğin, manuel eğimli tüp deneyleri veya otomatik analizörlerle yapılan deneyler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; yöntemin hızlı, düşük maliyetli olması, düşük örnek hacmi gereksinimi ve yüksek verimliliğe sahip olmasıdır.

Bu analiz, faktör beşin toplam fonksiyonel aktivitesinin eksiksiz bir kantitatif değerlendirmesini elde etmek için istem dışı aktive edilmiş ve trombinle aktive edilmiş faktör beş aktivitesini ölçer. Bu tekniği laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi Derek Tilley gösterecektir. Bir plazma örneğindeki faktör beş aktivitesini ölçmek için, tanım gereği mL başına bir ünite faktör beş aktivitesi içeren standart olarak normal insan plazması (NHP) kullanılarak; panel A'da fibrin pıhtısı oluşum süresinin, panel B'de ise fibrin pıhtısı oluşumunun başlangıç hızının faktör beş tek aşamalı aktivite standart eğrilerinin oluşturulması gerekir. Faktör beş eksik plazmayı, normal insan plazmasını, bilinmeyen örnek plazmaları ve tromboplastini 37 °C'de 10 dakika boyunca çözdürün.

Faktör beş eksik plazmayı nazikçe karıştırın, ayrı plastik yıkama tepsilerine aktarın ve buz üzerinde inkübe edin. Normal insan plazmasını ve bilinmeyen örnek plazmaları nazikçe karıştırdıktan sonra buz üzerinde saklayın. Faktör beş tek aşamalı aktivite standart eğrileri için distile su içindeki 25 millimolar Kalsiyum klorürü ayrı bir yıkama tepsisinde oda sıcaklığında saklayın.

1,5 ml mikro santrifüj tüpleri kullanarak, HBS pH 7.4 içerisinde normal insan plazmasının 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ve 512 kat şeklinde iki katlı seri dilüsyonlarının her birinden 200 µL hazırlayın, iyice vorteksleyin ve buz üzerinde inkübe edin. Plazma numunesi bilinmeyenleri için, 1,5 ml mikro santrifüj tüpleri kullanarak HBS pH 7.4 içerisinde normal insan plazmasının ve bilinmeyen numune plazmalarının her birinden 40 kat dilüsyon şeklinde 200 µL hazırlayın. Beş adet mikro kuyu şeridini mikroplaka okuyucunun şablon tutucusuna yerleştirin.

Mikroplaka okuyucuyu açın ve çok kanallı bir pipet kullanarak Softmax Pro mikroplaka uygulama yazılımına erişin. Çok kanallı pipet kullanarak tüm örnek mikroplaka kuyucuklarına eş zamanlı olarak 50 µL faktör beş eksik plazma ekleyin. Tek bir pipet kullanarak, hazırlanan normal insan plazmasının 10 seri dilüsyonunu, normal insan plazmasının 40 katlık dilüsyonlarını ve bilinmeyen örnek plazmaları ayrı mikroplaka kuyucuklarına 50 µL şeklinde ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak tüm örnek kuyucuklarına 50 µL tromboplastin ekleyin. Mikroplaka okuyucuda 25 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin; bir dakikalık inkübasyonun 15 ila 25 saniyelik kısmında çalkalama uygulayın.

MICROPLATE okuyucuya bağlı bilgisayarı kullanarak Softmax Pro Microplate uygulama yazılımına erişin. Mikroplaka okuyucuyu 405 nanometre absorbsiyans dalga boyu moduna, kinetik sıcaklığı 25 degrees Celsius'ye ayarlayın ve Mikroplaka okuyucuyu kalsiyum klorür ilavesinden sonraki ilk beş saniye boyunca çalkalayacak, ardından altı dakika boyunca her beş saniyede bir 405 nanometrede absorbsiyans ölçecek şekilde programlayın. Bundan sonra, hesaplanan pıhtılaşma sürelerine beş saniyelik çalkalama aralığı dahil edilmez; iki çok kanallı pipeti aynı anda kullanarak örneklerin bulunduğu iki mikroplaka şeridine 50 microliters kalsiyum klorür ekleyin.

15 saniye bekleyin ve deneyi başlatmak için bilgisayardaki Softmax Pro'da hemen başlat simgesine basın. Analiz edilen her plazma örneği için pıhtı oluşum süresi belirlenir ve absorbansın yarı maksimal artışına ulaşmak için geçen saniye cinsinden süre olarak tanımlanır. Pıhtı oluşumunun başlangıç hızı, absorbansın zamana karşı artış grafiğinin doğrusal kısmındaki ilk beş zaman noktası boyunca absorbans artış hızı olarak tanımlanır.

Pıhtı oluşumunun boyutu, çalışmanın sonunda pıhtı oluşum olayı sırasında ulaşılan maksimum ve minimum absorbans arasındaki fark olarak tanımlanır. Normal insan plazmasının seri dilüsyonu için pıhtı oluşum süresini, başlangıç hızını ve boyutunu belirlemek için Softmax Pro'daki zamanla ABSORBANS profillerini kullanın. Faktör V tek aşamalı aktivite standart eğrilerini oluşturmak için, 40 kat dilüe edilmiş normal insan plazmasının ve örnek plazma bilinmeyenlerinin pıhtılaşma sürelerini kullanın ve faktör beş aktivitesini, faktör beş tek aşamalı aktivite standart eğrisinden mL başına ünite cinsinden ekstrapole edin.

Bu, trombin tarafından kasıtlı aktivasyon gerçekleşmemiş faktör beş tek aşamalı aktivitesini temsil eder. Bu, mikroplaka okuyucu tarafından oluşturulan faktör beş analizindeki fibrin pıhtısı oluşumunun zaman içindeki temsili bir örneğidir. Profil, tek bir mikroplakada 32 kat dilüe edilmiş normal insan plazması kullanılarak gerçekleşen fibrin pıhtısı oluşumunu temsil etmektedir.

Dikey eksen, fibrin pıhtı oluşumu sonucunda 405 nanometrede meydana gelen absorbans değişimini göstermektedir. Pıhtı oluşum süresi, absorbans-zaman eğrisinin orta noktası olarak 36,4 saniye şeklinde hesaplanmıştır. Pıhtı oluşumunun başlangıç hızı, dakikada 611,88 mili ünite olarak hesaplanmıştır.

Bulut oluşum derecesi 0,35 birim olarak hesaplanmıştır. Faktör beş analizi, başlangıç hızını ve bulut oluşum derecesini doğru bir şekilde ölçmektedir. Analiz tamamlandığında kuyucukların incelenmesi, pıhtı oluşumunun gerçekleştiğini doğrulamıştır.

Tüm reaksiyonlar, tromboplastin ve kalsiyum klorür sonrası maksimum absorbans ile başlangıç absorbansı arasında 405 nanometrede 0,35 ile 0,45 birim arasında değişen genel bir absorbans değişimi ile yaklaşık olarak aynı pıhtı oluşum düzeyine ulaşmıştır. Normal insan plazması için faktör beş tek aşamalı aktivitesinin temsili örnekleri; saniye cinsinden pıhtılaşma süresine karşı mililitre başına birim cinsinden faktör beş aktivitesini gösteren standart eğri ve dakika başına mili birim cinsinden başlangıç pıhtı oluşum hızına karşı mililitre başına birim cinsinden faktör beş aktivitesi sırasıyla panel A ve panel B'de gösterilmiştir.

Faktör beş normalde trombin ile aktive olduğu için, aktif ko-faktör faktör beş A'nın ölçümü amacıyla, trombin eklemesi ve inkübasyon sonrası yapılan ikinci bir analiz, bir plazma örneğinin faktör beş iki aşamalı aktivitesini doğru şekilde ölçmek için kritiktir; faktör beş iki aşamalı analizi için eklenen trombin ile kasıtlı aktivasyon gerçekleştirilir. HBS pH 7.4 içerisinde 100 nM nihai konsantrasyona sahip 200 ila 300 µL saflaştırılmış trombin hazırlayın ve buz üzerinde inkübe edin; yukarıdaki normal insan plazmasının 120 µL'sini ve örnek plazmaları, 2.8 mM içeren 170 µL HBS pH 7.4 ile 40 kattan 100 kata kadar dilüe edin.

Kalsiyum klorür. Her bir örneğe, 10 nanomolar nihai konsantrasyon elde etmek için 10 µL trombin ekleyin. İyi bir şekilde karıştırmak için vorteksleyin ve 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin; normal insan plazmasını ve örnek plazmaları, 400 µL HBS pH 7.4 ekleyerek 500 kat seyreltin.

SoftMax Pro'daki absorbans-zaman profillerinden, her bir bilinmeyen plazma örneği testi için normal insan plazmasının pıhtılaşma süresini belirleyin. 500 katlık dilüsyonu dikkate alarak, pıhtılaşma süresine karşı aktivitenin verildiği faktör beş tek aşamalı standart eğrisini kullanarak her bir örneğin pıhtılaşma süresinden faktör beş iki aşamalı aktivitesini hesaplayın. Bu, faktör beş iki aşamalı aktivitesini veya trombin ile kasıtlı aktivasyon sonrası aktiviteyi temsil eder.

Toplam faktör beş aktivitesi, faktör beş iki aşamalı aktivitesinden faktör beş tek aşamalı aktivitenin çıkarılmasıyla hesaplanabilir. Normal insan plazmasındaki ve yaygın damar içi pıhtılaşma veya DIC olan dokuz hastadan alınan plazmalardaki faktör beş aktivitesini ölçmek için log pıhtılaşma süresine karşı log faktör beş aktivitesi standart eğrisi kullanılmıştır. Dokuz DIC hastasının tamamında, faktör beş tek aşamalı aktiviteleri ve pıhtı oluşumunun başlangıç hızları ortalama olarak sırasıyla %54 ve %18 oranında azalmış durumdaydı. DIC hastalarında faktör beş iki aşamalı ve toplam aktivite, normal insan plazmasına kıyasla ortalama %44 ve %42 oranında azalmıştır.

Faktör beş ve DIC hastaları, uzamış bir süre ve azalmış fibrin pıhtısı oluşum hızıyla sonuçlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bu yöntemi laboratuvarınızda nasıl uygulayacağınız konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Yöntem, plazmadaki herhangi bir koagülasyon faktörünün aktivitesini ölçmek için kolayca uyarlanabilir, bu da onu geniş bir araştırma ve klinik uygulama yelpazesi için uygun hale getirir.

Nihayetinde, faktör V hakkındaki bu bilgiler, DIC gibi trombotik veya kanama bozukluklarının daha erken teşhis ve tedavisi aracılığıyla sağlık hizmetleri ortamlarını olumlu yönde etkileyecektir.