Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Bu deneyin amacı, primer nöron hücre kültürü sisteminin herpes simplex virüsü latansı ve reaktivasyonunu incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle RA embriyolarından superior servikal ganglion nöronlarının izole edilmesi ve nöron dışı hücrelerin eliminasyonundan sonra disosiye edilen ganglionlardan izole edilen nöronların kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Latent bir HSV enfeksiyonu, litik replikasyon inhibitörü varlığında nöronları enfekte etmek için bir EGFP virüsü kullanılarak oluşturulur.

Bir sonraki adım, latent enfekte kültürlerin reaktivasyonunu indüklemektir. Son olarak, reaktivasyon verimliliği EGFP ekspresyonunun zaman içindeki seyri izlenerek değerlendirilir. Nihayetinde, kimyasal inhibitörler, RNA interferansı ve gen iletimi kullanımı aracılığıyla farklı nöronal sinyal yolaklarının herpes simpleks virüsü latansını ve reaktivasyonunu nasıl regüle ettiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, herpes simplex virüsü latansını konak nöronunda düzenleyen etkileşimlerin moleküler düzeyde ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, herpes simplex virüsü latansı alanındaki "latent genomu baskılayan sinyaller nelerdir?" ve "reaktivasyon moleküler düzeyde nasıl tetiklenir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nöronlarda bu yöntem, HSV-1 latansı hakkında içgörü sağlayabilir.

Bu yöntem diğer nörotrofik alfa herpes virüsleri için de uygulanabilir. Prosedürü gerçekleştirecek olanlar, laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrenciler Marigo Kochi ve Julian Kim'dir. Bu protokol için üst servikal ganglionlar veya SCG nöronları, gebe bir dişi sıçanın rahminden çıkarılan E 21 sıçan yavrularından izole edilir. Bir diseksiyon davlumbazında çalışarak, makasla omuzların hemen üzerindeki boyun tabanını hedef alıp başı gövdeden ayırarak her bir yavruyu sakrifiye edin. Ganglionları açığa çıkarmak için, başı boyun kısmı yukarı bakacak şekilde üç noktadan 23 gauge iğnelerle sabitleyin.

Önce omuriliği sabitleyin. İkinci olarak, ön deriyi burun üzerinden çekip sabitleyin ve üçüncü olarak özofagus ile trakeyi boynun arka kısmından uzaklaştırarak sabitleyin. Karotis arter bifurkasyonunu bularak SCG'yi tespit edin.

Karotis arteri çift bir yapıdır. Boynun her iki tarafında birer bifurkasyon bulunur, bu nedenle popülasyon başına iki SCG vardır. SCG, dalın hemen altında yer alır.

Bifurkasyonun iki ucunu birbirinden çekerek SCG'yi arterlerden ayırın. SCG, bifurkasyonu çevreleyen opak sarımsı adipoz dokuya kıyasla yarı saydam ve renksizdir. Gangliyonları 12 mililitre L 15 içine yerleştirin.

Buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde glikoz ile desteklenmiş besiyeri. Tüm SCG'ler embriyolardan toplandıktan ve nazikçe çekildikten sonra, gangliyonları bir dakika boyunca santrifüjleyin. 600 RPM'de, fazla besiyerini uzaklaştırın Reese.

Gangliyonları, tripsin ve kollagenaz içeren bir mililitre L 15 besiyerinde süspande edin. 37 °C'de 24 dakika boyunca inkübe edin.

Her sekiz dakikada bir karıştırın. Ardından, tripsin santrifüjünü inaktive etmek için 10 mililitre deniz medyumu ekleyip bir dakika boyunca santrifüjleyin. 600 RPM'de, tripsin kollagenaz medyumunun mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın ve gangliyonları 10 mililitre C medyumu ile yıkayıp 600 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Bu yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. Yıkama ortamını uzaklaştırın ve ganglionları, beş mililitrelik bir şırıngaya takılı 21 gauge iğne kullanarak maksimum 15 yukarı-aşağı döngüsü ile titrasyon yaparak ayırmak için bir mililitre C ortamında yeniden süspande edin. Çökelmiş kütlelerin çoğunluğu ayrılana kadar 23 gauge iğne ile titrasyonu tamamlayın.

Ayrıştırılmış nöronları 70 mikronluk bir naylon filtreden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe süzerek kalan hücre kümelerini giderin. Canlı hücre sayısını belirlemek için, filtrelenmiş hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik bir alikot çekerek tripan mavisi ile karıştırın. Boyayı aktif olarak dışlayan hücrelerin sayısını bir hemositometre kullanarak sayın.

Ardından, kolajen ve laminin ile önceden kaplanmış 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna, C medyumunda bulunan 100 µL içerisinde toplam 5.000 ile 6.000 canlı hücre dağıtın; C medyumu 50 ng/mL sinir büyüme faktörü içermelidir. 37 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, yani in vitro birinci gün veya DIV 1'de, nöronların uygun şekilde yapışıp yapışmadığını ve bazı aksonal projeksiyonların büyümesini kontrol edin.

Kuyucuklardaki C medyasını, 50 µL nörobazal medyum veya NGF, Acho ve beş florolu iki doksiüridin içeren NBM ile değiştirin. Hücrelerin kurumasını önlemek için medyayı her seferinde bir sıra şeklinde değiştirin. Kültürleri 37 °C'de beş gün boyunca inkübe edin.

Nöronal olmayan hücrelerin öldüğünü ve nöronların büyüdüğünü doğrulamak için kültürü günlük olarak izleyin. Prosedürün bu kısmına in vitro altıncı günde başlamak için, nöronal olmayan destek hücrelerinin çoğunun elendiğinden emin olun. Nöronların gereksiz fiziksel manipülasyonunu her zaman en aza indirmek son derece önemlidir.

Besiyerinin uzaklaştırılması ve değiştirilmesi işlemi çok nazik ve yavaş bir şekilde yapılmalıdır; aksi takdirde ortaya çıkan mekanik stres nöron canlılığını etkileyebilir. Her kuyucuktaki mevcut besiyerine, son konsantrasyonu 100 micromolar olacak şekilde asiklovir veya bir CV ekleyin. Mekanik kuvvetin ertesi gün hücreleri olumsuz etkilemediğinden emin olmak için CV'yi yavaşça ve nazikçe ekleyin.

DIV yediye gelindiğinde, SCG kültürlerini, viral litik protein US 11'e füzyonlanmış bir EGF raporeri eksprese eden rekombinant HSV 1 ile bir ila iki arasındaki bir enfeksiyon multiplisitesinde enfekte edin. Seyreltilmiş virüsü doğrudan kuyucuktaki mevcut medyuma ekleyin. Bir yalancı enfekte kontrol ve bir litik enfeksiyon dahil edin.

CV içermeyen besiyerindeki pozitif kontrol. Enfeksiyonun 37 °C'de iki ila üç saat boyunca ilerlemesine izin verin. Ardından, enfeksiyon besiyerini NGF ve CV içeren taze NBM ile değiştirin. Enfeksiyon besiyerini değiştirirken son derece nazik olmak kritiktir. Plakayı kendinize doğru eğin ve besiyerini kuyucuğun tabanından yavaşça uzaklaştırın.

Ardından, pipet ucunu kuyucuğun dibi yerine çeperine yöneltin ve medyanın hücrelerin üzerine yavaşça süzülmesini sağlayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için medyayı her seferinde bir sıra olacak şekilde değiştirin. Kültürleri, HSV 1 latansını destekleme kapasitelerini bozmamak için mümkün olduğunca nazikçe hareket ettirerek inkübatöre geri yerleştirin.

Kültürleri, virüsün latens durumuna geçeceği 6 gün boyunca 37 °C'de muhafaza edin. Bu süre zarfında, litik replikasyonun bir göstergesi olarak us 11 EGFP ekspresyonunu izlemek için floresan mikroskop kullanın.

Beklendiği gibi, yalancı enfekte kontrol grubunda GFP ekspresyonu görülmemelidir. S 11 EGFP yalnızca enfeksiyonda tespit edilmelidir. CV uygulaması yapılmayan pozitif kontrol kuyucukları, başarılı bir primer enfeksiyona ve produktif litik replikasyona işaret eder.

DIV 14'te reaktivasyonu değerlendirmek için, CV içeren medyayı daha önce yapıldığı gibi CV içermeyen taze medya ile dikkatlice değiştirin. Pipet ucunu kuyucuğun tabanına değil, yan duvarına yönlendirin ve uygunsa medyanın hücrelerin üzerine nazikçe süzülmesine izin verin. 20 micromolar konsantrasyonda LY 2 9 0 0 4 gibi farmakolojik veya biyolojik değişkenleri ekleyin.

Latent enfeksiyonlu ve A CV ilele tedavi edilmiş kültürlerde GFP ekspresyonu saptanmamalıdır. Hücreleri beş ila altı günlük bir süre boyunca 37 °C'ye geri döndürün. Reaktivasyon geçiren nöronları tespit etmek için canlı kültürleri floresan mikroskop kullanarak izleyin.

Reaktivasyon frekansı, EGFP pozitif nöronlar içeren kuyucukların sayısı sayılarak ve bunun toplam örnek kuyucuk sayısına oranı olarak ifade edilerek hesaplanır. Bu şekil, bilinen bir reaktivasyon indükleyicisi olan trigger statinin, enfekte olmuş geç dönem SCG kültürlerine uygulandığı bir örneği göstermektedir. Reaktivasyon, ilaç tedavisini takiben beş günlük bir süre boyunca her gün floresan mikroskobu kullanılarak izlenmiş ve skorlanmıştır.

TSA ile reaktivasyon, iki gün içinde maksimumun %50'sine ulaşır; beş güne gelindiğinde ise reaktivasyon %60'a ulaşır. DMSO ile temsil edilen bazal veya spontan reaktivasyon, bu deneydeki işlem görmemiş kontrol kültürlerinde yaklaşık %10'dur ve bu in vitro sistem kullanıldığında tipik olarak %5 ile %20 arasında değişir. Enfekte SCG kültürlerinin geç evreleri de LY 2 9 0 0 4 ile işleme tabi tutulmuştur.

LY ile indüklenen reaktivasyon kültürleri; viral DNA sentez inhibitörü olan fosfo, asetik asit ve burada gösterildiği gibi her iki bileşiğin birlikte uygulandığı kültürlerle karşılaştırılmıştır. LY 2 9 4 0 0 2 ile reaktive olması için indüklenen kültürlerde US 11 EGFP ekspresyonunun PAA tarafından engellenmesi, US 11 EGFP ekspresyonunun viral DNA replikasyonuna bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, stres veya mekanik hareketlerin tetiklediği artan spontan reaktivasyonu önlemek için steril tekniğe çok dikkat edilmesi ve CG kültürünün mümkün olduğunca nazik bir şekilde işlenmesi önemlidir. Kültürlenmiş nöronlarda HSV one latent enfeksiyonları oluşturmak için bu prosedür takip edildikten sonra, HSV one latansını ve reaktivasyonunu düzenleyen nöronal fonksiyonları karakterize etmek amacıyla S-H-R-N-A, knockdown ve vahşi tip ile mutant gen kaybının ektopik ekspresyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

HSV 1'in, BSL 2 güvenlik önlemleri gerektiren bir insan patojeni olduğunu unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce BSL 2 koşulları altında çalışma konusunda deneyimli olmanız gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, latent HSV 1 enfeksiyonlarını kurmak için SCG kültürlerinin nasıl oluşturulacağı ve nöronlarda reaktivasyonun nasıl etkili bir şekilde indükleneceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.