Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş

Bu geleneksel olmayan protokol, insan epitel hücrelerini insan in vivo dokusunu taklit eden organotipik 3D modeller şeklinde kültüre etmek için kolay ve sağlam bir sistem sunmaktadır. İlk olarak, epitel hücreleri bir doku kültürü flaskında konfluen bir monokatman haline gelene kadar kültüre edilip hasat edilir ve ardından STLV biyoreaktöründe mikro taşıyıcı boncuklarla birleştirilir; düşük akışkan kayma kuvvetine sahip sabit bir serbest düşüş ortamı oluşturmak için platform üzerindeki STLV döndürülerek hücrelerin boncuklara tutunması ve büyümesi sağlanır; böylece 96 saat sonra ve yaklaşık olarak takip eden her gün hücresel agregatlar oluşur.

Agregat oluşumu sonrası hücresel metabolizmayı karşılamak için SDLV içindeki medyayı yenileyin; agregat oluşumu ve hücresel diferansiyasyon tamamlandıktan sonra, gelişimsel ilerlemeyi izlemek için haftalık olarak ışık mikroskobu ile görüntü örnekleri alın. Agregatları, sonraki deneysel analizler ve assayler için ekim yapın. Nihayetinde bu sistem, çok sayıda bilimsel araştırma için in vivo benzeri organotipik model sistemler oluşturabilir.

Bu tekniğin geleneksel hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, epitelyal hücrelerin farklılaşarak doku benzeri agregatlar şeklinde polarize olması, dolayısıyla morfolojik ve fonksiyonel olarak gerçek insan dokusuna benzer davranışlar sergilemesidir. Bu 3D model sistemi; epitelyal hücre biyolojisi, konak-patojen etkileşimleri ve sisteme dahil edilebilecek hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler hakkında daha derinlemesine bilgi sağlar. Dr. Andrea Radkey.

Laboratuvarımdaki bir doktora sonrası araştırmacı, yavaş dönen lateral damar biyoreaktörünü detoksifiye etmek için uygulanacak bu prosedürü şimdi gösterecektir. Açık portları luer kapaklarla kapatın. STLV'yi %95 etanol ile doldurun ve 24 saat boyunca dengeye gelmesini bekleyin.

Etanolü uzaklaştırın, ardından sterilize edilmiş distile su ile doldurun ve satıcı tarafından sağlanan araçları kullanarak 24 saat boyunca inkübe edin; tüm vidaları gevşetin ve STLV'den merkez tıpası çıkarın. Bunları bir sterilizasyon poşetine yerleştirin ve 110 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. STLV'yi yeniden monte edin ve steriliteyi sağlamak için detoksifikasyon işlemini tekrarlayın.

Ardından, STLV vidalarını sıkın. Her porta önceden sterilize edilmiş tek yönlü stopkokları takın. Şimdi, 10 mililitrelik ve beş mililitrelik lure lock şırıngaların pistonlarını çıkarın ve pistonları ambalajlarının içinde muhafaza edin.

Sterilliği korumak için şırıngaları durdurma musluğuna vidalayın. STLV tamamen dolana ve beş mililitrelik şırınga dolmaya başlayana kadar 10 mililitrelik şırıngaya DPBS ekleyin. Ardından, steril pistonları her bir şırıngaya geri yerleştirin ve şırınga pistonlarını sırayla iterek biyoreaktördeki tüm kalıntı kabarcıkları giderin.

Muslukları kapatın ve STLV'yi döner dikey platforma takın. 50 milliliter'lik konik bir tüpte sızıntıları izlemek için en az 24 saat boyunca döndürün. 250 milligrams cyto dex microcar boncuklarına 15 milliliters DPBS ekleyin ve soğuduktan sonra otoklavlayın.

Epitelyal hücreler için kültür medyası ile üç kez DPBS yıkama işlemini gerçekleştirin. Boncukları yeniden süspand etmek için tüpü çalkalayın. Ardından boncukları 15 milliliters kültür medyasında yeniden süspande edin.

Öncelikle 1x10⁷ epitel hücresini doku kültürü flasklarında monolayer olarak kültüre edin. Hücreleri hasat edin, sayılarını belirleyin ve tripan mavisi dışlama boyaması ile hücresel canlılığı saptayın. Hücreleri hazırlanan boncuklara ekleyin.

Tüm hücrelerin aktarıldığından emin olmak için konik tüpü durulayın. Ardından, DPBS'yi ve şırıngaları STLV'den çıkarın. Ayrıca, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak merkez porttaki tıpayı çıkarın.

Epitel hücre boncuk süspansiyonunu STLV'ye yükleyin. Tüm hücreleri ve boncukları aktarmak için konik tüpü bir kez durulayın. Ardından merkez port tıpasını yerine takın.

Ardından, beş mililitrelik ve 10 mililitrelik bir şırınganın pistonlarını çıkarın ve pistonları ambalajlarının içinde muhafaza edin. Steriliteyi korumak için, şırınganın inç girişlerini açık musluklarla kapatın. STLV'yi besiyeri ile doldurun.

Pistonları değiştirin ve musluğu kapatın. Şimdi, yeni ekilmiş STLV kültürünü 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde 30 dakika boyunca rotasyon olmadan dengeleyin. STLV'yi inkübatörden çıkardıktan sonra musluğu açın.

Pistonlar yardımıyla tüm kabarcıkları uzaklaştırın ve musluğu kapatın. Ardından, STLV'yi inkübatör içerisinde 20 RPM hızında sürekli rotasyona ayarlayın. 96 ila 120 saat sonra, şırıngaları çıkarıp boncukların ve hücrelerin çökmesine izin vermek için STLV'nin her iki musluğunu açarak medyumu değiştirin.

Çökelme gerçekleştikten sonra, besleme protokolünü uygulamak için şırıngaları kullanarak yan porttan medyanın yaklaşık %75'ini boşaltın. Hücresel metabolizmaya bağlı olarak, gerektiğinde medyayı yenilemeye devam edin. Ayrıca, agregatların büyümesini ve canlılığını her beş ila yedi günde bir izleyin.

Agregatların parçalanmasını önlemek için, ucundan yaklaşık iki santimetre kesilmiş ve sterilize edilmiş 1000 microliter pipet ucu kullanın. Merkez porttan dikkatlice 200 microliters agregat alın ve iki adet 1.5 milliliter tüpe paylaştırın. Alikotlardan birini hücresel canlılığın izlenmesi için kullanın. Hücreleri boncuklardan ayırdıktan sonra, canlılığı tripan mavisi dışlama yöntemi ile değerlendirin.

Hücresel agregatların görüntülenmesi için boyama. İkinci 1.5 mL'lik Agregat alikotuna 0.5 ile 1 mL arası besiyeri ekleyin ve kesilmiş bir 1000 µL pipet ucu kullanarak küçük bir Petri kabına aktarın. Agregatları görüntüleyin.

Bazı epitel hücre modelleri için ters ışık mikroskobu kullanırken, agregatlar hasat edilmeden yaklaşık bir hafta önce, kültür havalandırmasını artırmak amacıyla agregatların tek kullanımlık bir kaba aktarılması gereklidir. Analiz için, şırıngaları STLV'den çıkarın ve yan porttan medyanın yaklaşık %50'sini boşaltın. Merkez tıpaları çıkarın ve tüm içeriği merkezi porttan 50 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice boşaltın.

STLV'yi beş mililitre besiyeri ile iki kez durulayın ve durulama sıvılarını toplanan agregatlar ile birleştirin. Ardından, agregatları 50 mililitrelik konik tüpten Harv'a aktarın. Bir hafta sonra, olası analiz formatları, deneyler ve analizler için agregatları dikkatlice toplayın; diferansiye insan epitelyal agregatları STLV biyoreaktör sisteminde büyütülmüştür.

SEM ve TEM görüntüleri, STLV'de 39 gün boyunca büyütülen insan vajina hücrelerinden elde edilmiştir. 3D agregatların dokulara benzer ultrastrüktürel özellikler, mikro kıvrımlar, invajinasyonlar, hücre içi salgı vezikülleri ve apikal yüzeydeki mikrovillüsler sergilediğine dikkat ediniz; 3D vajina hücrelerinin konfokal immünofloresan mikroskopi görüntüleri, müsin ile epitel hücrelerine ve terminal diferansiyasyona özgü belirteçlerin ekspresyonunu göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili fenotipler, aynı zamanda bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için mükemmel bir platform görevi görmektedir.

Hücre canlılığını, metabolizmasını veya proliferasyonunu ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan MTT testi, çeşitli kimyasalların ve bileşiklerin toksisitesini ölçmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, test bileşikleri ile yapılan işlem sonrası toksisite, trypan blue dışlama yöntemi ile ölçülebilir. Bu örnekte, NONOXINOL nine uygulaması sonrası vajinal agregatlar, servikal X eksplan modellerine benzer bir toksisite yanıtı göstermiş, ancak monokatmanlara kıyasla farklı bir profil sergilemiştir.

3D agregatlar fonksiyonel olarak yanıt verebilirler; örneğin, toll benzeri reseptörler tarafından tanınan mikroplardan türetilen moleküllerle stimülasyon yapıldığında tepki verirler. Agregatlar yanıt vererek IL six proteini ve progesteron reseptörünün transkript ekspresyonu dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinler salgılar. Vajinal hücrelerde hormon stimülasyonuna yanıt veren bir reseptör de gözlemlenebilir.

3B agregatlar sadece patojen ve hormon moleküllerine yanıt verme kapasitesine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda fonksiyonel olarak tip iki herpes simpleks virüsü enfeksiyonunu da destekleyebilirler. HSV iki ile enfekte edilmiş 3B vajinal agregatların konfokal mikroskopi görüntüsü enfeksiyonu kanıtlamaktadır. Agregatlar içindeki bireysel hücrelerin fiziksel ve fonksiyonel özellikleri akış sitometrisi ile de nicelendirilebilir; örneğin, bireysel vajinal hücrelerde MUC1 yüzey ekspresyonunu ölçmek için bir akış sitometrisi analizi uygulanabilir.

3D vajinal agregatlar, gelişimlerini tamamladıktan sonra yüzeylerinde, monoton tabakalara kıyasla daha düşük bir yüzdeyle muck one eksprese ettiler. Bu teknik, doku biyolojisi ve bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların yapıyı ve uyarılara verilen fizyolojik yanıtları incelemesine olanak sağlamıştır. Bu organotipik modelleri kullanarak, insan biyolojisini daha iyi taklit edebiliyoruz.