Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Bu prosedürün genel amacı, hücresel tanıma süreçlerinde yer alan, özellikle membrana gömülü reseptör proteinleri dahil olmak üzere yeni hücre dışı protein etkileşimlerini keşfetmektir. AveXis yaklaşımı, bu protein etkileşim sınıfının karakteristik özelliği olan oldukça zayıf etkileşim afinitelerinin ve membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olduğu gerçeğinin üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. Bu, öncelikle hücre yüzeyi reseptörlerinin hücre dışı bölgelerinden oluşan rekombinant bir protein kütüphanesi derlenerek gerçekleştirilir.

Bu, reseptörlerin ekto domain bölgelerini hem monomerik biyotinillenmiş yemler hem de pentamer enzim etiketli avlar olarak çözünür fragmanlar şeklinde üretecek ekspresyon plazmitleri tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinlerin etkileşim taramasına hazır hale getirilmesi için eksprese edilmesi ve normalize edilmesidir. Disülfit bağları ve glikozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonların eklendiğinden emin olmak için tüm proteinler memeli hücrelerde üretilir.

Protokoldeki kritik bir adım, kütüphane içindeki yem ve av proteinlerinin tamamının eşik seviyelerinin altına normalize edildiğinden emin olmaktır. Ardından heyecan verici kısım olan yeni etkileşimlerin taranması gelir. Yemler bir mikroplaka içindeki ayrı kuyucuklara dizilir ve ardından avlar kullanılarak etkileşimler için analiz edilir.

Ardından bir yıkama adımı gerçekleştirilir. Son adım, yem protein dizilerinde yakalanan herhangi bir avı tespit etmek için enzime uygun substratın eklenmesidir. Nihayetinde, bir VEX taramasının sonuçları, hangi hücre yüzeyi reseptörlerinin bağlanma ortakları oluşturabildiğini ve dolayısıyla hücreler arasındaki tanıma ve iletişim süreçlerinde yer alabileceğini gösterebilir.

Bu tekniğin, maya iki hibrid veya biyokimyasal saflaştırmalar gibi popüler protein ekstraksiyon yöntemlerine göre temel avantajı, özellikle hücre dışı protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için tasarlanmış olmasıdır. Bu yöntem, özellikle membrana bağlı reseptör proteinler arasındaki yeni etkileşimlerin keşfi için uygundur. Membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olması ve tipik karşı reseptör etkileşimlerinin son derece zayıf olması nedeniyle, bu etkileşimlerin diğer teknikler kullanılarak tespit edilmesi güçtür.

Bu yöntem, hücrelerin birbirlerini nasıl tanıdığı ve birbirleriyle nasıl iletişim kurduğuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Moleküler düzeyde; yumurta ve sperm yüzeyinde sergilenen hangi reseptör proteinlerinin birleştiği veya miyosit füzyonu veya nöral krista oluşumu gibi hücresel davranışlardan hangi reseptör ligand etkileşimlerinin sorumlu olduğu gibi temel biyolojik süreçlerle ilgili soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşımdaki temel zorluk, etkileşimlerin taranacağı "bait and pray" (yem ve dua et) protein kütüphanelerini derlemektir.

Yem ve av proteinlerinin, analiz için gereken eşik seviyeleri dahilinde normalize edildiğinden emin olmak da oldukça önemlidir. Bu işlem, yanlış negatif ve yanlış pozitif sıklığını azaltır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrim, doktora eğitimim sırasında CD 200 hücre yüzey proteini için bir bağlanma ortağı belirlemeye çalışırken ortaya çıktı.

Temel olarak, bu özel hücre yüzeyi reseptörünün bağlanma örüntüsünün ne olduğu sorusunu soruyordum. Bugün bile bu, cevaplanması teknik olarak zor bir soru olmaya devam ediyor; ancak o dönemde insan genomu tamamlanmak üzereydi ve genomdaki tüm hücre yüzeyi reseptörlerinin tam bir listesine sahip olduğumuz için, artık bu reseptör proteinleri seti içerisinde hangilerinin teknik olarak etkileşime girebileceğini sorabileceğimizi fark ettim.

Bu, yanıtlanması çok daha kolay bir sorudur ve AveXis, bu soruyu yanıtlamak için geliştirdiğimiz yöntemdir. Bir yem ve av ekspresyon vektörleri kütüphanesi oluşturulduktan sonra, bunları HEC 2 9 3 E hücrelerine transfekte etmeye hazırlanın; verimli biotinilasyon sağlamak için transfeksiyondan bir gün önce hücreleri 50 milliliters freestyle 2 9 3 medyumunda, mililitre başına 250, 000 hücre yoğunluğunda ekleyerek işe başlayın. Av proteinlerini değil, yem proteinlerini üretmek için kullanılan medyumu d biotin ile takviye edin; tüm plakalar hazırlandığında, hücreleri standart koşullarda gece boyunca inkübe edin.

Biyotin düşük çözünürlüğe sahip olduğu ve çözeltisi hassas olduğu için, ek biyotini tartıp ardından besiyerine eklemeyi ve ertesi gün şiddetli bir şekilde çalkalamayı tercih ederiz. Biyotinize yemler üretmek için, 50 mililitre kültürlenmiş hücreyi uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 25 mikrogram yem veya av plazmidi ile transfekte edin. Yem konstrüktünü, hasat başına salgılanan formdaki ELI protein biyotin ligazı kodlayan plazmidlerle 10'a bir oranında kotransfekte edin.

Transfeksiyondan beş gün sonraki kültürler, önce hücrelerin 3000 ×g'de 20 dakika santrifüjlenerek çöktürülmesi ve ardından süpernatanın 0,22 µm'lik bir filtreden süzülmesiyle hazırlanır. AveXis'in temel özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanması sayesinde, bu proteinlerin eşik aktiviteler dahilinde seyreltilebilmesi veya konsantre edilebilmesidir. Rekombinant proteinlerin ekspresyonlarının dört büyüklük derecesine kadar değişkenlik gösterdiğini saptadık; bu nedenle normalizasyon adımı, tarama aşamaları sırasında yalancı pozitiflerin ortaya çıkma olasılığını azaltır.

Yemin proteininin normalizasyonuna başlamak için, streptavidin bağlama bölgeleri için biyotinilelemiş yemin proteini ile rekabet edeceği için konjuge olmamış serbest biyotin, diyaliz yoluyla ortamdan uzaklaştırılmalıdır; işleme yem proteinini bir diyaliz tüpüne yerleştirerek başlayın. Rekombinant proteinlerin etkili bir şekilde diyaliz edilmesini sağlamak için, diyaliz tüpünün yeterli yüzey alanına sahip olmasının önemli olduğunu saptadık. Genellikle, diyalize edilen hacim için fiilen gerekenden iki ila üç kat daha fazla tüp kullanırız.

Diyaliz işlemi gerçekleştikten sonra, yem proteinini 24 saatlik bir süre boyunca PBS gibi uygun bir tampona karşı kapsamlı bir şekilde diyalize edin. Bir ELISA işlemi, streptavidin kaplı bir mikroplaka kuyucuklarının BSA içeren PBST ile 15 dakika boyunca bloke edilmesiyle başlatılır. Bu sırada, temiz bir plaka üzerinde, yem proteinlerinin %2 BSA içeren PBST içinde dörtlü bir seri 1/3 seyreltmesini hazırlayın.

15 dakikalık inkübasyonun ardından, dilüsyonu strep TTR kodlu plakaya aktarın ve plağı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra kuyucukları yıkayın ve ardından her bir kuyucuğa 100 µL 2 µg/mL OX 68 ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyonun ardından, bir yıkama serisi daha gerçekleştirin ve plakayı anti-US alkalen fosfataz ile yükleyin.

Plakayı oda sıcaklığında üçüncü bir saat boyunca inkübe edin. Şimdi plağı üç kez PBST ile yıkayın ve son olarak PBS ile yıkayın. Kalan deterjanı uzaklaştırmak için bir saat sonra, di etil amin tamponu içerisinde 1 mg/mL substrat 1 0 4'ten 100 µL ekleyin.

Oda sıcaklığında 405 nanometrede absorbansı ölçün. Dört farklı diyalize edilmiş yem süpernatantından oluşan bir dilüsyon serisi, anti CD4 etiketli monoklonal antikor kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Seyreltilmemiş ekspres yem proteinleri, streptavidin kaplı bir plakanın tüm biotin bağlanma bölgelerini doyurmak için yetersizse, proteini bir Viva spin konsantratör kullanarak konsantre edin. Aksi takdirde, yem proteinini %2 BSA içeren PBST içinde seyreltilmiş konsantrasyonda kullanın.

Bu miktar, analizin biotin bağlama bölgesini doyurmak için yeterlidir. Pre-proteinlerin ekspresyon seviyelerini, beta laktamaz enzim aktivitesini kullanarak nicel olarak belirleyin. Paraproteinleri içeren süpernatantın %2BSA içeren PBST tamponu ile bir dilüsyon serisini hazırlayarak başlayın.

Ardından, dilüsyonun 20 µL'sini bir plakaya yüklenmiş 60 µL nitro stepin çözeltisine ekleyin. Plakayı derhal bir plaka okuyucuya aktarın ve santrifüj konsantratörleri veya %2 BSA içeren dilüsyon PBST kullanarak sonraki 20 dakika boyunca her dakika bir kez 485 nm'deki absorbansı ölçün. Örneklerin nihai konsantrasyonunu, analizdeki tüm nitroları yaklaşık yedi dakikada hidrolize edecek şekilde ayarlayın; bu da dakika başına yaklaşık iki ol nitro dönüşümüne karşılık gelir.

AveXis taramasına, strep TAVR ENC kaplı bir plakayı PBST ile yıkayıp plağı bir kağıt havluya vurarak kurulayarak başlayın. Ardından, her kuyucuğa BSA içeren PBST ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, istenmeyen protein bağlanma bölgelerini bloke eder.

Her bir kuyucuktaki bloklama solüsyonunu, plakayı lavabonun üzerinde hafifçe sallayarak uzaklaştırın ve uygun kuyucuklara 100 µL normalize edilmiş biyotinillenmiş monomerik yem ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından yem örneklerini plakadan tekrar sallayarak uzaklaştırın ve plakayı PBST ile üç kez yıkayın.

Ardından üçüncü yıkamadan sonra hafifçe vurarak kurulayın. Şimdi her kuyucuğa 100 µL normalize edilmiş pentamer av konstrüktü ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, plakayı üç kez daha PBST ile ve son olarak sadece PBS ile yıkayın.

Son olarak, her kuyucuğa 60 µL nitrous seven çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya tercihen 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, pozitif etkileşimler kırmızıya dönmüş olacaktır. Görsel kayıt için plakanın fotoğrafını çekin ve ardından bir plaka okuyucu kullanarak reaksiyonları 485 nm absorbans değerinde nicelleştirin.

AveXis tarama reaksiyonunun başlangıcından yaklaşık 10 dakika sonra, hem antikor aracılı av yakalama kontrolünde hem de pozitif kontrol etkileşiminde sarıdan kırmızıya renk değişimleri gözlemlenmiştir. Bu renk değişimi, substrattaki nitrojenin hidrolizini göstermektedir. Bazı pozitif etkileşimler bu zaman diliminde gözlemlenebilir, ancak çoğu etkileşimin ortaya çıkması birkaç saat sürmüştür.

Tipik olarak, yaklaşık %0,4 ile %0,6 arasında bir pozitif hit oranı gözlemlenmiştir. Protein kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, bu tekniğin tarama kısmı hızlıca gerçekleştirilebilir. Bir etkileşim tanımlandıktan sonra, günde 12 plakete kadar tarama yapmak oldukça mümkündür.

Bir sonraki en önemli adım, öncelikle etkileşimin taze ve bağımsız protein preparatları kullanılarak tekrarlanabildiğinin gösterilmesidir. İkinci olarak, etkileşimin yem-av oryantasyonundan bağımsız olup olmadığını, yani karşılıklı olarak gerçekleşip gerçekleşmediğini her zaman belirleriz. Bu işlem, yem vektörü domenlerinin av vektörüne ve tersine klonlanmasını içerir.

Tekrarlanabilen ve karşılıklı olan etkileşimler yüksek güvenilirlikte kabul edilir ve her zaman pozitif olduğu gösterilmiştir. Yeniden tanımladığımız etkileşimleri ek olarak doğrulamak için yüzey plazmon rezonansı gibi diğer teknikleri kullanmayı tercih ederiz. Önemli olan şudur ki bu işlem, saflaştırılmış iki bileşenin doğrudan etkileşime girebileceğini kanıtlar ve ayrıca bağlanmanın doygun olduğunu, dolayısıyla spesifik olduğunu göstermek için de kullanılabilir.