Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, çift kanallı eş zamanlı görüntüleme kullanarak T-hücresi reseptör sinyal olaylarının izlenmesine yönelik bir prosedürü açıklamaktadır. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya TURF mikroskobu kullanılarak, öncelikle T-hücreleri GFP etiketli ZAP 70 kodlayan bir plazmid ile transfekte edilir; ardından lipid çapalı peptid MHC kompleksleri, adezyon molekülleri ve ko-stimülatör moleküller içeren, cam destekli bir lipid çift tabakası hazırlanır.

T-hücre reseptörleri peptid MHC kompleksleri ile etkileşime girdiğinde, ZAP 70 transfekte edilmiş T hücreleri çift katmanlı yapıya eklenir. T-hücre reseptörü ile ilişkili CD3 zincirleri, SARC ailesi kinazı LCK tarafından fosforillenebilir ve zap 70 kinazı sitoplazmadan bölgeye çağrılır. Ardından T-hücre reseptörü floresanla işaretlenir ve hücrelerin, lamel camdan daha düşük kırılma indeksine sahip bir ortamda daldırıldığı ve toplam iç yansıma gerçekleşecek bir açıyla lazer ışınıyla aydınlatıldığı görüntüleme işlemi gerçekleştirilir.

Bu, cam-su arayüzeyinde, ortam içinde eksponansiyel olarak sönümlenen ve 100 ila 200 nanometre arasında bir penetrasyon derinliğine izin veren bir evanesan dalga oluşturur. Böylece yalnızca plazma membranındaki veya buna çok yakın konumdaki floroforlar uyarılır. Elde edilen görüntülerin analizi, sinyalizasyonun T hücresi reseptör mikro kümelerinde gerçekleştiğini ortaya koyar.

TIRF mikroskobisi veya konvansiyonel konfokal mikroskobinin temel avantajı, sinyal kümeleri veya TCR mikro kümeleri gibi sinyal komplekslerinin kolayca görselleştirilebileceği daha yüksek bir çözünürlük elde etmenizdir. Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacılar Travis Crites ve Chen, maxi nucleo affection teknolojisini kullanarak primer fare T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini ve ardından antijen içeren cam destekli lipid çift katman ile stimüle edilerek total internal yansıma floresan mikroskobisi (TIRFM) ile nasıl görüntüleneceklerini gösterecekler.

Bu yöntem; T hücreleri, B hücreleri, doğal öldürücü hücreler ve mast hücreleri dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücrelerindeki sinyal iletimini incelemek için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır. Yöntem geniş bir uygulama alanına sahiptir ve özellikle sinyal iletiminin kümeler halinde gerçekleştiği durumlar olmak üzere, memeli hücrelerindeki çoğu reseptör sistemini incelemek için kullanılabilir. T hücrelerinin transfeksiyonunun çok zor olması nedeniyle, yönteme yeni başlayan kişiler başlangıçta zorluk yaşayabilirler.

Buna ek olarak, T-hücresi canlılığı ve transfeksiyon verimliliğinin yanı sıra bilar kalitesinin ve mikroskop hizalamasının standartlara uygun olması için hassas bir koordinasyon gereklidir. Bu prosedürün ilk adımı, bir AM maxa mouse T-hücresi nükleofil efektör kiti kullanarak, naif veya in vitro aktive edilmiş primer T-hücrelerine ekspresyon plazmidleri ve GFP ile işaretlenmiş kodlayan sinyal moleküllerinin transfekte edilmesidir. Bu çalışmada kullanılan tüm T hücreleri, K'nın MHC molekülü IE'sinde bulunan MCC peptidini tanıyan A-N-D-T-C-R'yi eksprese etmiştir. Burada gösterilen transfeksiyon prosedürü, üretici tavsiyelerine göre gerçekleştirilmektedir.

Bununla birlikte, transfeksiyondan sonra T hücrelerinin canlılığını artırmaya yönelik bazı ipuçları sunulmuştur. Hem canlılık hem de transfeksiyon verimliliği, in vitro aktive edilmiş T hücrelerinde naif hücrelere göre daha yüksektir; bu nedenle, bu protokol başlangıçta in vitro aktive edilmiş T hücrelerini kullanmaktadır. Kit ile sağlanan 1,9 mililitre ortamı, 20 mikrolitre bileşen A'yı, 20 mikrolitre bileşen B'yi ve 100 mikrolitre fetal bovine serumu iki mililitrelik bir tüpte birleştirerek her bir transfeksiyon için iki mililitre desteklenmiş T-hücre ortamı hazırlayın.

Bir 12 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre besiyeri aktarın. Besiyerinin dengelenmesi için plakayı 37 °C'deki nemlendirilmiş bir inkübatöre en az bir saatliğine yerleştirin; soğuk olan veya pH değeri 7.2 olmayan besiyerinde transfekte edilmiş hücrelerin resüspansiyonu hücre ölümüne yol açacaktır. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 82 µL fare T-hücre nükleo efektör çözeltisini 18 µL supplement 2 ve konsantrasyonu 0.5 µg/µL'den düşük olmayan beş mikrogram endotoksin içermeyen plazmid DNA ile birleştirin ve vurarak iyice karıştırın.

Beş ila 10 milyon hücreyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 75 ×g hızında santrifüjleyin. Hücre peletini transfeksiyon karışımı içinde yeniden süspande etmek için süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını vakumlu aspiratörle uzaklaştırın ve büyük hücre kümeleri kalmayana kadar hücre peletini yavaşça ve nazikçe üç ila dört kez aspire edin. Süspansiyonu, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak bir pipet yardımıyla dikkatlice sertifikalı bir amaxa vete'ye aktarın.

Nükleo efektör cihazı üzerindeki nükleer efektör program X 0 0 1'i seçip onaylayın. Vete'yi Q vete tutucuya yerleştirin ve seçilen programı uygulamak için düğmeye basın. Ardından, vete'yi ve önceden dengelenmiş kültür ortamını derhal çeker ocağa aktarın.

Sağlanan plastik pipeti kullanarak, önceden dengelenmiş ortamdan yaklaşık 500 microliter miktarını vete'ye ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu plaktaki ortama damla damla ekleyin.

GFP etiketli proteinlerin düşük düzeyde ekspresyonuna izin vermek ve aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktların oluşumunu en aza indirmek için hücreleri 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bu bölümde, mikroskobun tüm bileşenlerine güç verilmeden önce, iki kanallı eş zamanlı görüntüleme için mikroskobun hizalanma yöntemi açıklanmaktadır. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın.

Ardından, tüm donanım bileşenlerinin yazılım tarafından tanındığından emin olun. Yazılım herhangi bir hata mesajı vermeden başladığı için tüm bileşenler tespit edilmiştir. Bir µL alt çözünürlüğü seyreltin.

Kolokalizasyon standardı olarak kullanmak üzere, Flores parlak çok renkli floresan mikrokürelerini iki mililitre PBS içine ekleyin. Ardından, mikroküre süspansiyonundan 0,25 mililitreyi bir lab tech sekiz kuyucuklu oda sistemli lamel cam sisteminin her bir kuyucuğuna ekleyin. Oda lam sistemini objektifin üzerindeki platforma yerleştirin.

Ardından, canlı önizlemede cam üzerindeki boncuk emilimünü odağa getirin. Sol panel, GFP transfekte hücrelerin görünür olacağı kanaldır. Sağ panel ise canlı hücre görüntüleme deneyleri sırasında işaretlenmiş TCR'yi gösterecektir.

XY, Z fiber çıkışının Y hizalamasını kullanarak, lazer ışınının objektiften çıkıp tavana yansıyacağı şekilde ışın konumunu ayarlayın. Bunu, objektifin cam düzleminin odaklandığı konumda olması sırasında yapmanız önemlidir. Tavandaki ışın dağınıksa, ışın kolime edilmemiş demektir.

Deneyde kullanılacak her bir lazer hattı için tam kolimasyon test kolimasyonunu sağlamak amacıyla Z mikrometresini ayarlayın. Ardından, bir lazer güç ölçer kullanarak, her kanal için lazer gücünü 20 ila 30 µW değerine ayarlayın. T hücreleri lazer radyasyonuna karşı son derece hassastır ve aydınlatma toplamda 50 µW ile sınırlandırılmıştır.

Sıradaki adım, turf için açıyı ayarlamaktır. Işının objektiflerin optik eksenine göre açısı 90 dereceye yaklaşana kadar, ışını tavandan uzaklaştırmak için fiber lansmanındaki Y hizalama mikrometresini çevirin.

Tam iç yansıma için kritik açıya ulaşıldığında, lazer ışığı artık objektiften çıkmayacaktır. Turf hizalamasının sağlanıp sağlanmadığını değerlendirmek için, örtü camı düzlemi boyunca yukarı ve aşağı odaklama yapın. Burada, yüzeye tutunan boncuklar odağın dışına çıktığında, solüsyonda yüzen birçok boncuğun görülebileceğini fark edin. İyi bir turf hizalaması elde etmek için, ışının objektife göre açısını artırmak gerekir.

Işın açısı artırıldığında, yüzeye yakın bölgede yüzen boncuklar gözden kaybolmaya başlar ve ara yüzeye tutunmuş boncukların yoğunluğu artar. Şimdi, ara yüze tutunmuş boncuklar odak dışına çıkarıldığında, çözelti içinde yüzen hiçbir boncuk görünür kalmaz. Bu noktada, yalnızca lamıla tutunmuş boncukların odaklanabilmesi sayesinde düzenek doğru şekilde hizalanmış olur.

Ardından, kırmızı ve yeşil floresan kanalları birbiriyle hizalamak için boncuklara odaklanın ve her iki kanalda üretilen görüntülerdeki ayırt edici özelliklerin konumlarını karşılaştırın. Bir kamera standındaki X ve Y mikrometre vidalarını kullanarak, boncukların göreceli konumlarını mümkün olduğunca birbirine yaklaştırın. İki kanal arasındaki mekansal hizalamayı sağlamak için her iki görüntünün sol alt kadranındaki parlak boncuğu dikkate alın.

Bu özellik, her iki görüntüde de aynı göreceli konuma getirilir. Her iki kanaldan görüntüyü yakalayın ve kaydedin. Bu görüntüler, iki kanalı hizalamak için bir kolokalizasyon standardı olarak kullanılacaktır.

Bu hizalamaya dair bir örnek, hizalama öncesinde burada görülmektedir. Alt çözünürlüklü boncukların iki kanalından gelen görüntülerin üst üste bindirildiği bu görselde gösterildiği gibi, kanallardan biri diğerine göre dönmüştür. Ayarlamaların ardından görüntüler, burada gösterildiği şekilde hizalanmıştır.

Hizalamanın kalitesi, GFP transfekte edilmiş canlı hücrelerin görüntüleri karşılaştırılarak daha ayrıntılı bir şekilde incelenebilir. İki kanaldan elde edilen Laila podyumlarının nasıl mükemmel şekilde hizalandığına dikkat edin. Bu işlem, floresan mikroboncuklar kullanılarak oluşturulan kalibrasyon aracılığıyla iki görüntünün hizalanmasından sonra gerçekleştirilmiştir.

Mikroskop kurulduktan sonra, antijen sunan cam destekli lipid çift katmanları içeren akış odaları hazırlanır ve önce substratla etkileşime giren TRANSFEKTE edilmiş T hücrelerini görüntülemek için turf M uygulanır. Ana ve Dustin tarafından açıklanan protokolü takip ederek, Ni-NTA lipidleri, adhezyon molekülü ICAM-1 ve peptit MHC kompleksleri içeren cam lam üzerinde oluşturulmuş düzlemsel lipid çift katmanlı bir akış odası kurulur. MCC yüklü IEFK'ler, histidin etiketleri aracılığıyla çift katmana dahil edilir.

Ko-stimülatör molekül CD 80 dahil edilir. Bir GPI çıpası kullanarak, akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreyi sabitlemek için bir gergi çubuğu yardımıyla hazneyi mikroskop tablasındaki bir adaptör plakasına tutturarak stabilize edin. Ardından, sıcaklığını kontrol etmek için üretici tarafından sağlanan ısıtma elemanını akış hücresine takın.

Objektifi bir çift katman üzerine konumlandırın ve objektifin ve akış hücresinin ısıtılmasını sağlamak için çift katman düzlemini odaklayın; bölme sıcaklığını 37 °C'ye getirmek için akış hücresi ve objektif ısıtıcılarını açın. Dört saatlik inkübasyonun ardından, transekte edilmiş T hücrelerini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 80 ×g hızda santrifüjleyin. Hücreleri 300 µL H-B-S-B-S-A tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, TCR'yi etiketlemek için Fab için nihai konsantrasyonu 10 µg/mL veya tek zincirli değişken fragman için 20 µg/mL olacak şekilde H 57 FAB veya H 57 tek zincirli değişken fragman ekleyin.

Hücreleri beş mililitrelik bir faks tüpüne aktarın. Ardından, bir mililitrelik slip tip şırınga kullanarak hücreleri üç yollu bir vana aracılığıyla akış odasına enjekte edin. Çift kanallı canlı görüntüleme, TCR ve GFP kanallarının canlı önizlemesini gösterecek şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın ve transfected hücrelerin bulunduğu bir alan bulun.

TCR ve GFP arasındaki yoğunluk farkları nedeniyle, hücrelerin her iki kanalda da görüntülenebilmesi için görüntülerin ölçeklemesi gerçek zamanlı olarak ayarlanması gerekebilir. Burada olduğu gibi, herhangi bir lateral membran boyanmasını tespit etmek için cam düzleme odaklanarak turf aydınlatmasını doğrulayın. Lateral membranlar odağa girmiyorsa, turf hizalaması uygun demektir.

Bu canlı önizlemede, lateral membran boyaması hem lamın düzleminde hem de mikroskobun iyi bir tür hizalamasına getirilmesi için lam odak dışında bırakıldığında belirgindir. Lazerin objektife göre açısı artırılır ve lateral membran odak dışına çıkar. 10 saniyelik aralıklarla tekil görüntüler ve zaman ayarlı sekanslar yakalamaya başlayın.

Hücreler beş dakika boyunca, kare mikrometre başına altı peptit yüklü hist-etiketli IEFK molekülü, kare mikrometre başına 100 Alexa 647 konjuge hist-etiketli ICAM-1 molekülü ve kare mikrometre başına 100 GPI çapalı CD80 molekülü içeren cam destekli INTA çift katmanları üzerinde inkübe edildi. Alexa 546 konjuge H57 FAB fragmanının sürekli varlığında çift kanallı eşzamanlı kazanımlı turf mikroskopi gerçekleştirildi.

TCR'yi boyamak için hücreler, çift tabakayla ilk temasın üzerinden bir saate kadar geçen süre boyunca görüntülendi. Hücre başına ZAP 70 küme sayıları, otomatik bir küme sayım yazılımı kullanılarak analiz edildi. Her durumda en az 40 hücre analiz edildi.

Yüklenen peptitler iç resimde belirtilmiştir. ICAM 1, kare mikrometre başına 100 molekül Alexa 647 konjugeli His-etiketli ICAM 1 içeren çift katmanlar üzerindeki hücreleri ifade eder. Şekilde gösterildiği üzere, kare başına 10 saniyede çekilen bu videoda görülebileceği gibi, zap 70 bağımlı sinyal iletimi TCR mikro kümelerinde ve yalnızca agonist ligandlara yanıt olarak gerçekleşir.

Agonist peptitlere yanıt olarak gelişen TCR sinyalleşmesi, temas alanının çevresinde ZAP 70'i mobilize eden TCR mikro kümelerinin sürekli oluşumuyla sürdürülür. Bu videoyu izledikten sonra, maksima nükleer affeksiyon teknolojisi kullanılarak primer T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini ve TURF mikroskopi kullanılarak GFPT sinyal moleküllerinin TCR mikro kümelerine alımının nasıl uygun şekilde görüntüleneceğini iyi kavramış olmalısınız. Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde yedi saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, primer hücrelerinize karşı çok nazik olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Deneyin her adımında hücreler ne kadar sağlıklı olursa, transfeksiyon veriminiz o kadar yüksek olur ve görüntülemede o kadar çok hücre yakalarsınız. T hücreleri oldukça hareketlidir ve sonuç olarak, TCR ve GFP kanallarının ardışık görüntülenmesi, TCR mikro kümelerinin ve hücrelerin hareketi nedeniyle iki görüntünün mükemmel şekilde hizalanmamasına neden olur.

Bu sorunun üstesinden gelmek için, çift kanallı eş zamanlı veri toplama özellikli turf mikroskobu geliştirdik.