Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, fare beynine nakledilen kök hücrelerin in vivo davranışlarının standartlaştırılmış bir takibini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle EGFP ve lusiferazı birlikte eksprese eden kemik iliği kaynaklı stromal hücrelerin, floresan işaretli mikron boyutlu demir oksit partikülleri ile markalanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise MPIO ile markalanmış BMC'lerin fare beyin dokusuna uygun şekilde enjekte edilmesidir.

Ardından, hücre greftlerinin sağkalımı ve lokalizasyonu, biyolüminesans görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak non-invaziv olarak takip edilir. Son adım, in vivo görüntüleme sonuçlarının postmortem histolojik analiz kullanılarak doğrulanmasıdır. Bu yöntemler, kök hücrelerin fare beynine transplantasyon sonrası davranışları hakkında bilgi sağlayabilir; ayrıca model organizmalar ve hastalık çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

İntravenöz ve intraserebral enjeksiyonların uygulanmasının zor olması ve hayvan sağkalımı açısından belirli riskler taşıması nedeniyle, hayvan uygulama adımlarının öğrenilmesi güçtür; bu nedenle bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşır. Bu prosedüre başlamak için, subkonflüen düzeyde büyüyen bir hücre kültürüne 75 × 10⁶ glacial blue mikron boyutlu demir oksit partikülü ekleyin. Partiküllerin endositoz yoluyla alınmasını sağlamak için bunları 16 saat daha inkübe edin, ardından kalan partikülleri yıkayarak uzaklaştırın.

Hücre konfluensini ve G-B-M-P-I-O'nun homojen dağılımını sağlamak için hücrelerin 24 saat daha büyümesine izin verin. Ardından, EGFP pozitif ve G-B-M-P-I-O pozitif hücrelerin toplam EGFP pozitif hücre miktarına oranını hesaplayarak, partikül alımını floresan mikroskobu ile görsel olarak doğrulayın. Sonrasında, G-B-M-P-I-O ile işaretlenmiş BMSC lusiferaz EGFP hücrelerini 10 mililitre ile iki kez yıkayın.

Hücreleri tripsin EDTA ile PBS içinde işleyin ve ardından hasat edin. Daha sonra hücreleri yıkayın ve PBS içinde 133 × 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Son olarak, transplantasyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.

Bu prosedürde, fareyi kilogram başına 80 miligram ketamin ve kilogram başına 16 miligram ksilazin karışımının intraperitonal enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Farenin uykuya dalması için beş dakika bekleyin, ardından steril manipülasyonlara olanak sağlamak için başını tıraş edin. Daha sonra fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve cildi alkol ile dezenfekte edin.

Ardından,yetersiz hidrasyonu önlemek için gözlerine pomad uygulayın. Hipokampusu hedeflemek amacıyla kafatasına ulaşmak için kafa derisine orta hat boyunca bir insizyon yapın. Bir dental frez kullanarak kafatasında, posteriora doğru iki milimetre ve laterale doğru iki milimetre mesafede bir delik açın.

Bu aşamada, hücre süspansiyonunu kısa süreliğine vorteksleyin, ardından hücre süspansiyonunu şırınga ile aspire edin. Sonrasında, şırınga iğnesini dura altına 2,5 milimetre derinliğe indirin ve basınç dengelenmesi için bir dakika bekleyin. Bir dakika sonra, iğneyi dura altındaki iki milimetre konumuna geri çekin.

Ardından, otomatik bir mikroenjeksiyon pompası kullanarak hücre süspansiyonundan 0,70 µL/dk hızında 3 µL enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen hücre süspansiyonunun geri akışını önlemek için beş dakika daha bekleyin. Daha sonra, iğneyi yavaşça geri çekin.

Ardından, deri kenarlarını dezenfekte edin ve ardından deriyi sütüre edin. Dehidrasyonu önlemek için cilt altına 300 µL %0,9 sodyum klorür çözeltisi enjekte edin. Son olarak, biyolüminesans görüntüleme yapabilmek için farenin anesteziden ayılmasını sağlamak amacıyla onu bir ısıtıcı lambanın altına yerleştirin.

Fareyi %3 izofluran ve oksijen karışımı ile anesteziye alın. Ardından fareyi foton görüntüleme cihazına yerleştirin. İzofluranı %1,5'e ayarlayarak anestezi seviyesini düşürün. Daha sonra, vücut ağırlığının kilogramı başına 150 mg olacak şekilde d-lüsiferazı intravenr olarak enjekte edin.

Photo vision yazılımını kullanarak beş dakika boyunca görüntü alın. Ardından, M three vision yazılımını kullanarak görüntü işleme yapın ve sabit ilgi alanları (ROI) kullanarak gözlemlenen sinyali nicelendirin. Manyetik rezonans görüntüleme yapmak için, fareyi oksijen ve nitrik oksit karışımı içinde %3 ISO fluorine ile anestezi altına alın.

Ardından fareyi, yatay 9,4 Tesla MR sisteminin sabitleyicisine yerleştirin. İzofloranı %1'e ayarlayarak anestezi seviyesini düşürün. Sonrasında, kurumayı önlemek için farenin gözlerine pomad uygulayın. Bundan sonra, vücut ısısını izlemek için rektal prob kullanın.

Ardından, solunum hızını izlemek için farenin karnının altına bir sensör yerleştirin. Solunum hızını dakikada 110 ± 10 seviyesinde tutun ve vücut sıcaklığını 37 ± 0,5 °C'lik dar bir aralıkta sabit tutun. Daha sonra, yüzey RF bobinini fare başının üzerine yerleştirin.

Fareyi mıknatısın ortasına yerleştirin. Ardından ParaVision 5.1'i açın. Sekans parametrelerini ekteki makaleye göre ayarlayın. Daha sonra, spesifik anatomik bilgi edinmek amacıyla 10 adet koronal T2 ağırlıklı spin eko görüntü seti alın.

70 µm² düzlem çözünürlüğünde kök hücre göçünü incelemek amacıyla iki yıldızlı ağırlıklı gradyan eko görüntüleri elde edin. Bu adımda, fareyi sakrifiye edin ve beyni çıkarın. Beyin dokusunu oda sıcaklığında, PBS içindeki %4 paraldehit ile iki saat boyunca tespit edin.

İki saat sonra, beyin dokusunu dört santigrat derecede farklı sükroz gradiyentlerine yerleştirerek dehidre edin. Ertesi gün, beyin dokusunu sıvı azot kullanarak dondurun ve kesit alma işlemi yapılana kadar dokuyu eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Beyin dokusunu bir kriyostat kullanarak 10 µm kalınlığında kesitler halinde dilimleyin. Ardından, boyanmamış kriyoseksiyonları bir floresan mikroskobu altında, G-B-M-P-I-O partiküllerinden gelen mavi floresans ve EGFP eksprese eden hücrelerden gelen yeşil floresans için inceleyin. Daha sonra, boyanmamış kriyoseksiyonları inflamatuar hücrelerden gelen kırmızı-yeşil arka plan floresansı açısından inceleyin.

Açıklanan glacial blue MPIO etiketleme prosedürü, floresan mikroskobu ile kolayca doğrulanabilen BMSC, lusiferaz EGFP hücrelerinin oldukça verimli bir şekilde etiketlenmesini sağlar. Ardından, G-B-M-P-I-O ile etiketlenmiş BMSC, lusiferaz EGFP hücrelerinin farelerin MSS'sine nakledilmesiyle, hücresel greftin sağkalımı lusiferaz aktivitesine dayalı in vivo biyolüminesans görüntüleme ile izlenebilir. Ek olarak, nakledilen hücrelerin kesin lokalizasyonu, glacial blue MPIO'nun demir içeriğine dayalı in vivo manyetik rezonans görüntüleme ile takip edilebilir.

Son olarak, histolojik analiz, biyolüminesans görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme ile elde edilen sonuçların doğrulanmasını sağlamıştır. Stabil hayatta kalma, gelişimi sonrası zaman içinde stabil bir EGFP ekspresyonu ile onaylanmıştır. Bu teknik, moleküler görüntüleme alanındaki araştırmacıların, farklı nörodejeneratif hastalık hayvan modellerinde kök hücre transplantasyonu sonrası hücresel ve moleküler olayları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme yöntemlerini uygulayarak moleküler görüntüleme yapma ve in vivo sonuçları postmortem histolojik değerlendirme ile yeterince doğrulama konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.