Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler

Hücre içi kalsiyumun, sinaptik plastisitenin çeşitli mekanizmalarının önemli bir parçası olduğu öne sürülmüştür. Bu fikirler, kalsiyumdaki değişimler ve sinaptik etkinlikteki farklılaşmalar eş zamanlı olarak izlenerek test edilebilir. Burada, kalsiyum görüntülemenin hücre içi kayıt ile birleştirilmesiyle bunun nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz.

Deneylerimiz, mollusk türü Aplysia Cahora'nın bir ganglionu ile yürütülmektedir. Bu preparat; büyük tanımlanmış nöronlar, apia için doğal olan düşük sıcaklıklar, görüntülemeyi kolaylaştıran yavaş sinyaller gibi bir dizi avantaja sahiptir; ancak gösterdiğimiz genel teknikler diğer sistemlere kolaylıkla aktarılabilir. Merhaba, ben New York City'deki Mount Sinai Tıp Fakültesi'nde, Fishburg Nörobilim Bölümü ve Freedman Beyin Enstitüsü'nde, Elizabeth Cropper'ın laboratuvarından Colin Evans.

Bugün, mollusk *Aplysia cahora*'nın bukkal ganglionunda hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişimlerin ve sinaptik etkinliğin eş zamanlı görüntülemesini göstereceğiz. Hücre içi kalsiyumu tespit etmek için, presinaptik bir nörona hücre IMP geçirgen kalsiyum indikatör boyası olan calcium orange enjekte edeceğiz. Ardından preparat mikroskobun altına alınacak ve pre ve postsinaptik nöronlara keskin elektrotlar yerleştirilecektir.

Tekrarlanan presinaptik stimülasyon, artan postsinaptik potansiyel veya PSP amplitüdü olarak gözlemlenen güçlendirilmiş bir postsinaptik yanıtla sonuçlanır. Kalsiyum indikatör boyasının floresan sinyalini ölçmek, presinaptik hücre içi kalsiyumdaki eş zamanlı değişimleri tespit etmemizi sağlayacaktır. Başlamak için, yaklaşık 150 gram ağırlığındaki yetişkin bir hayvana 75 ml izotonik magnezyum klorür solüsyonu enjekte ederek anestezi uygulayın, anestezi altındaki hayvanı balmumu kaplı bir kaba iğneleyin, ardından kaba forseps ve makas kullanarak hayvanın ayağına bir insizyon yapın ve bukkal kütleyi açığa çıkarın.

Bukkal ganglion, bukkal kitlenin ventral tarafında yer alır ve birbirine bağlı iki hemi gangliondan oluşur. Hayvanın beslenme davranışının oluşturulmasına ve kontrolüne diğer ganglйонlardaki nöronlarla birlikte katkıda bulunan birkaç yüz nöron içerir. Tüm bukkal sinirleri ince bir makasla keserek ganglionu dikkatlice serbest bırakın ve hayvandan çıkarın.

Ardından, serbest kalan ganglionu yapay deniz suyu ile doldurulmuş sil guard kaplı bir kabın tabanına iğneleyin. Ganglion, bireysel nöronları açığa çıkarmak için uzaklaştırılması gereken bir bağ dokusu kılıfı ile sarılıdır. Bu kılıfı kesip çıkarmak için ince uçlu pens, iris makası kullanın ve son derece dikkatli olun.

Nöronların zarar görmesini önlemek için, görüntüleme sırasında herhangi bir hareket sorun yaratacağından, kılıfsız gangliyonu yaklaşık 15 dakikalık pinlerle sabitleyin. Hücre içi kayıt ve boya enjeksiyonu için keskin elektrotlar hazırlamak amacıyla, bir mikro elektrot çekici ile kapiler tüpleri çekin. Dış çapı bir milimetre olan ince duvarlı filament borosilikat cam kullanıyoruz.

Kayıt elektrotları, üç molar potasyum asetat ile doldurulduğunda yaklaşık 10 mega dirençte olmalıdır; bu nedenle D elektrotlarını doldurmak için puller cihazını buna göre ayarlarız. Çekilmiş elektrodun arka kısmını 10 milimolar kalsiyum oranj boya çözeltisine daldırın; elektrodun içindeki cam filament boyunca gerçekleşen kılcal hareket, boyayı uca çekecektir, ardından iyi bir elektriksel temas sağlamak için elektrodu 200 milimolar potasyum klorür ile geri doldurun. Elektrot özelliklerini iyileştirmek ve kayıt elektrodu direncini yaklaşık beş megaya düşürmek için özel yapım bir Bela kullanıyoruz.

Elektrot, bir alüminyum oksit süspansiyon akımı içerisine 45 derecelik bir açıyla tutulur. Süspansiyona sodyum klorür karıştırılması ve bir ohmmetre bağlanması, elektrot direncinin izlenmesini sağlar. Pah kırma işlemi sırasında, üzeri örtülmüş buckle ganglionlarını içeren kabı bir elektrofizyoloji düzeneğine aktarırız ve ilgilenilen nöronları, elektrotlarla onları delerek ve kimliklerini doğrulayarak tespit ederiz.

Nöronları kalsiyum görüntüleme için hazırlamak amacıyla, öncelikle hücre somasına boya dolu bir elektrot yerleştiririz ve 30 dakika boyunca hiperpolarize edici, 15 nano amp akım darbeleriyle boyayı elektrofizyolojik olarak yükleriz. D calcium orange hücreye girdikçe, SOR hafif pembe bir renk alacaktır. Ardından kayıt elektrotlarını dikkatlice geri çekeriz ve boyanın nöronun ince uzantılarına difüze olmasını sağlamak için preparatı en az 30 dakika bekletiriz.

Ardından, hazırlığın bulunduğu kabı bir floresan mikroskoba aktarın. Sabit tablalı dik bir mikroskop üzerinde 10x NA 0,3 su daldırma lensi kullanıyoruz; bu mikroskop, tabloyu değil lensi hareket ettirerek odaklama yapar. Bu özellik, manipülatörlerin kurulumunu kolaylaştırır.

Kayıt elektrotları için uygun bir filtre bloğu seçin. Bir SI üçlü filtre bloğu, kalsiyum oranj için doğru eksitasyon ve emisyon filtrelerini sağlayacaktır; kamera parametrelerini ve aydınlatma yoğunluğunu nötr yoğunluk filtreleri ve alan diyaframı ile ayarlayın. Daha fazla ışık daha az gürültü ile sonuçlanacaktır, ancak preparasyonun ağartılmasına (bleaching) neden olabilir.

Cool snap CCD kamera, saniyede yaklaşık 30 kare hızında 500'e 300 piksellik bir alanı ve iyi bir sinyal-gürültü oranı yakalayabilir. Işık kaynaklarının panjurlarını mümkün olduğunca kapalı tutarak fil nöronlarının aydınlatmasını en aza indirin. Görüntüleme yazılımında, ilgilenilen bölgeleri (ROI'leri) seçin.

Bu bölgeler, yazılımın yoğunluk ölçümlerini nereden yapacağını belirler. Genellikle presinaptik nöronun primer, sekonder ve tersiyer dallarını görüntüleriz. Daha sonra tüm diğer veri noktalarından çıkarılacak bir arka plan değeri elde etmek için difi nöronun yanına ek bir ROI yerleştirin.

Sinaptik iletimi indüklemek ve izlemek için pre- ve post-sinaptik nöronlarda hücre içi kayıt elektrotları kullanılır. Veri toplama yazılımını başlatmak için kameranın frame out tetikleyici sinyalini kullanırsanız, elektrofizyolojik ve görüntüleme veri toplama işlemleri arasında senkronizasyon sağlayabilirsiniz. Senkronizasyonu sağlamanın bir başka yolu ise kamera portunun içine bir LED yerleştirmektir.

Bu LED, kayıt oturumunun başında kısa süreliğine yakılarak bir senkronizasyon işareti sağlar. Tipik bir deney sırasında, kısa akım darbeleri enjekte ederek presinaptik nöronda aksiyon potansiyellerini tetiklersiniz. Bu örnekte, belirli hipotezleri test etmek için bir spike serisi ve buna karşılık gelen kalsiyum sinyalindeki artışları gösteriyoruz.

Kalsiyum sinyali manipüle edilebilir ve sinaptik iletim üzerindeki etkileri belirlenebilir. Örneğin, kalsiyum şelatörü EGTA gibi ilaçlar presinaptik olarak enjekte edilebilir veya perfüzyon sistemi aracılığıyla uygulanabilir. Veriler, görüntüleme yazılımından bir metin dosyasına ve ardından bizim durumumuzda Cambridge Electronic Design tarafından geliştirilen spike two olan, elektrofizyolojik verileri toplamak için kullanılan yazılıma aktarılarak analiz edilir.

ROI yoğunluk değerlerini ve buna karşılık gelen membran potansiyeli değişimlerini çizdirmek için özel olarak yazılmış bir betik kullanıyoruz; arka plan ROI'sinden elde edilen arka plan sinyalini çıkararak ve gösterilen denklemle bağıl değişimi hesaplayarak kalsiyum sinyalindeki değişimleri nicelendiriyoruz. F sıfır uyarılmadan hemen önceki floresansa, F ise uyarılma sırasındaki floresansa karşılık gelir. Burada, tanımlanan neuron B 21'deki kalsiyum floresansı değişimlerini görüntülediğimiz bir deneyin sonuçlarını gösteriyoruz.

Görüntülediğimiz bölge A'da belirtilmiştir; B1'de B21'de bir spike patlaması indükledik, bu da B8'de postsinaptik potansiyellere ve kalsiyum sinyalinde bir değişikliğe yol açtı. B2, kalsiyum şelatörü EGTA enjeksiyonunun etkisini göstermektedir; B21'deki spike'lar artık yaygın kalsiyum floresans artışlarını indüklememekte ve postsinaptik potansiyel genliği azalmaktadır.

Sonuç olarak, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun eş zamanlı olarak izlenmesi ve sinaptik iletim etkinliğinin değerlendirilmesi için kullanılabilecek teknikleri göstermiş olduk. Bu teknikler, çoğu fonksiyonel görüntüleme yöntemine kıyasla yalnızca mütevazı ekipmanlar gerektirmekte olup öğrenilmesi kolay ve hızlıdır.