Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir

Bu prosedürün genel amacı, genetik olmayan bir model sistemdeki belirlenmiş bir nöron popülasyonundan in vivo tek ünite yanıtlarını kaydetmektir. Bu, öncelikle ilgili beyin bölgesini açığa çıkarmak için bir kraniyotomi gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci adım, hedef nöronların projeksiyon yaptığı bölgeye floresan boya yerleştirmek için tungsten tellerin kullanılmasıdır.

Ardından, boya retrograd olarak taşınır ve bu da projeksiyon nöronlarının seçici olarak işaretlenmesiyle sonuçlanır. Son adım, tekil projeksiyon nöronunun işaretlenmiş aksonundan kayıt almaktır. Nihayetinde, sağlam bir devre içerisindeki merkezi duyusal nöronların evo'daki duyusal uyarana nasıl yanıt verdiğini göstermek için tek üniteli ekstraselüler kayıtlar kullanılır.

Bu yöntem, nöral devrelerin sinaptik girdilerin zamanlamasındaki milisaniye altı farkları nasıl tespit ettiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil nöronları, hatta aksonları ve genetik olarak erişilemeyen sistemleri hedefleyebilme yeteneğidir. Zayıf elektrikli balıklar, iletişim ve navigasyon için elektrik sinyallerini kullanırlar.

Sinaptik girdilerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farkları kullanarak farklı balıklardan gelen sinyalleri ayırt ederler. Elektrosensör devrelerindeki varsayılan zaman karşılaştırıcı nöronların bu kadar küçük zamanlama farklarını nasıl tespit edebildiğini araştırdık. Ancak bu teknik, görsel ve işitsel duyusal yollar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Hücrelerin küçük boyutu, çevreleyen dokuyla yoğun şekilde iç içe geçmiş olmaları ve hücre gövdesinin büyük kısmını kaplayan presinaptik terminaller nedeniyle bu hücrelerden sıvı elde etmek özellikle zordur. Tüm hücre kaydı sırasında yapılan hücre içi boya enjeksiyonu, söz konusu aksondan hedefli kayıtlar yapabilmek için in vitro ortamda tek bir hücreyi işaretler. Benzer şekilde, hücre dışı boya enjeksiyonunu takip eden retrograd transport, yüzeysel beyin bölgelerindeki projeksiyon nöronlarının seçici olarak işaretlenmesi için bir yöntem sağlar.

Bu yöntem, in vivo tek ünite kayıtları için görsel kılavuz sağlamak amacıyla kullanılabilir. D kodlu iğneyi hazırlamak için öncelikle, 160 µm çapındaki bir tungsten teli, nihai iğne ucu çapı 5 ila 50 µm olacak şekilde elektrolitik olarak sivriltin. Ardından, deneyden bir gece önce, genel anesteziyi indüklemek için iğne ucunu 10.000 moleküler ağırlıkta, Alexa fluor boyasıyla konjuge edilmiş 2 mM'lık bir dekstran çözeltisi ile kodlayın.

Balığı, 300 mg/L MS 2 22 çözeltisi içeren tank suyuna yerleştirin; dorsal vücut kas dokusuna 3 mg/mL konsantrasyonunda 100 µL flail enjekte ederek balığı immobilize edin ve elektriksel olarak sessizleştirin. Ardından, kayıt odasını tank suyu ile doldurun ve balığı odanın merkezindeki platforma ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra, bir pipet ucunu ağzına yerleştirerek, 100 mg/L konsantrasyonundaki havalandırılmış MS 2 22 çözeltisini dakikada 1 ila 2 mL hızında verin.

Ardından, balığı gövdesinin her iki yanından sabit çubuklarla ve mumla sabitleyin. Oküler damarlardaki sürekli kan akışını ve normal vücut rengini kontrol ederek balığın sağlık durumunu izleyin. Daha sonra platformu dikey eksen boyunca döndürün.

Platformun bir ucunu, balığın başının dorsal yüzeyinin bir tarafı suyun üzerinde kalacak, vücudunun geri kalanı ise su altında kalacak şekilde ayarlayın. Kurumayı önlemek için cildin su altında kalmayan herhangi bir bölümüne küçük bir parça Kim wipe yerleştirin. Bu prosedürde, başın açıkta kalan yüzeyine bir kulak çubuğu kullanarak %0,4 lidokain uygulayın.

Ardından, 6,2 cm boyutundaki bir balık için yaklaşık üç milimetre çarpı beş milimetre boyutlarında dikdörtgen şeklinde bir deri dokusu parçasını kesmek için bir neşter ucu kullanın. Dikdörtgenin lateral kenarı gözün merkeziyle aynı hizada olmalıdır. Dikdörtgenin anterior kenarı gözün hemen posteriorunda, medial kenarı ise orta hattın hemen lateralinde olmalıdır.

Ardından, bir pens yardımıyla dikdörtgen parçayı çıkarın. Kafatasını açığa çıkarmak için anterior melli bölgeden ek olarak 2,5 milimetrelik bir kare kesin. Skalpel bıçağını kullanarak fazla dokuları sıyırıp açığa çıkan kafatası yüzeyini tamamen temizleyin.

Ardından yüzeyi bir Kim wipe ve basınçlı hava ile tamamen kurulayın. Sonrasında, metal bir postu hızlı yapıştırıcı kullanarak kafatasının anterior medial açık bölgesine yapıştırın. Yapıştırıcı tamamen kuruyana kadar bekleyin.

6,2 santimetrelik bir balığın kafatasında, 0,5 milimetre çapında küresel uçlu karbür freze kullanılan bir diş hekimi matkabı ile yaklaşık iki milimetreye dört milimetre boyutlarında bir dikdörtgen çizin. Ardından, dikdörtgenin çevresini bistüri ve penset yardımıyla kesin. Sonrasında kafatasını soyarak ayırın.

Beyni açığa çıkarmak için, yaylı makas veya bir iğne kullanarak hem pigmente dura materi hem de şeffaf pia materi kesin. Ardından, anterior ekstra lateral nükleus ve posterior ekstra lateral nükleusu açığa çıkarmak için kesilen kısımları bir penset yardımıyla uzaklaştırın. Şimdi, daha önce hazırlanmış D kaplı bir iğneye sahip manipülatörü, ilgilenilen aksonları içeren hedef bölgenin üzerine yerleştirin.

Vakamızdaki posterior ekstra lateral nukleus için iğneyi hızla yaklaşık 25 micrometers doku içine yerleştirin. Boya 15 ila 30 saniye boyunca difüze olduktan sonra iğneyi geri çekin. Gerektiğinde yeni iğnelerle işlemi tekrarlayın.

Boyanın hedef bölgeye yayılmasını sağlamak için her birini farklı bir konuma yerleştirin. Ardından, boşluktaki fazla boyayı hickman's ringer çözeltisi ile yıkayın ve boyanın alınması ve taşınması için en az iki saat bekleyin. İlgili aksonları görüntülemek için, balığın bulunduğu kayıt odasını dik sabit tablası olan bir epi floresan mikroskobun objektifinin altına yerleştirin.

Respirasyon solüsyonunu taze tank suyuyla değiştirin ve aynı akış hızını koruyun. Ardından, topraklama telinin bir ucunu açığa çıkarılmış beyin boşluğuna yerleştirin ve diğer ucunu kayıt kafa aşamasının toprağına bağlayın. Son olarak, kuyruk tabanının yanına bir çift kayıt elektrodu yerleştirin.

Ardından elektrotları bir diferansiyel amplifikatöre ve kayıt cihazına bağlayın. Elektrik organ boşalım komutunu veya EODC'yi izlemek için, etiketli aksonların tam konumunu belirlemede referans noktaları olarak kullanılacak ana kan damarlarını içeren, düşük büyütmede görüntülenen beyin bölgesinin ölçekli bir taslağını hazırlayın. Öncelikle D yerleşimini doğrulamak için, yönlendirme amacıyla tüm dokuyu parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin.

Ardından floresan aydınlatma ile görüntüleyin. Posterior ekstra lateral nükleus difüz etiketleme göstermelidir. Sonrasında, yüksek büyütme altında, damarları referans noktası olarak kullanarak anterior ekstra lateral nükleusu bulun.

Filamanlı, dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,58 mm olan borosilikat kapiler cam kullanarak yüzeye yakın etiketlenmiş bir akson ararken alanı floresan ışıkla aydınlatın. Beş milimetre uzunluğunda dar bir şafta ve yaklaşık 1 ila 2,4 µm uç çapına sahip bir kayıt elektrodu çekin.

Elektrodu filtrelenmiş hickman ringer çözeltisi ile doldurun. Nihai uç direnci 16 ile 155 mega ohm aralığında olmalıdır. Elektrodu, basınç portuna sahip bir elektrot tutucuya yerleştirin.

Bunu, bir manipülatöre monte edilmiş olan kafa katına bağlayın. Ardından kafa katını bir amplifikatöre bağlayın. Görselde gösterilmeyen analogdan dijitale dönüştürücü bir veri toplama cihazı, amplifikatörü bilgisayara bağlar.

Ardından, elektrot hattına 30 milibar pozitif basınç uygulayın. Elektrodu doku yüzeyinden aksona doğru yavaşça ilerletin. Elektrot aksona yaklaştığında, elektrot aksonun yanındayken pozitif basınç aksonun hafif ancak fark edilebilir bir şekilde hareket etmesine neden olmalıdır.

Test stimülasyonları sunulurken aktiviteyi kaydedin. Elektriksel bir artefakt, kayıt ve stimülasyonun doğru gerçekleştiğini doğrulasa da, aksiyon potansiyeli görülmemelidir. Elektrottaki dışa doğru olan basıncı serbest bırakın ve stimülasyon ile kayıt işlemini tekrarlayın.

Ardından, aksonun elektrodun içine girmesini sağlayacak hafif bir vakum uygulayın. Stimülasyon ve kayıt işlemini tekrar edin. Artık stimülasyonlara yanıt olarak bazı aksiyon potansiyelleri görmelisiniz.

Aksiyon potansiyelleri görünür hale geldiğinde, basınç hattını kapatın. İstenen tüm kayıtlar tamamlandığında, balığın tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için tank suyunu litre başına 100 mg MS 2 22 içeren solunum çözeltisine geri döndürün. Balığı ötanize etmeden önce en az 10 dakika boyunca hiçbir EODC tespit edilmemelidir.

Burada, 0.1 milisaniye süreli, santimetre başına altı milivoltluk, monofazik kontralateral pozitif transvers kare dalga pulse stimülasyonu ile uyarılan beş örnek iz (trace) aksiyon potansiyeli gösterilmektedir ve burada, aynı ünitenin sıfır zamanında santimetre başına altı milivoltlık stimülasyonlarla uyarılmasıyla elde edilen 75 milisaniyelik bir kayıt penceresinin 20 tekrarı sırasındaki spike zamanlarını gösteren bir raster grafiği yer almaktadır. Süre aralıkları sağda listelenmiştir. Burada, yanıtları stimülasyon tekrarı başına spike sayısı olarak nicelleştiren bir stimülasyon süresi ayarlama eğrisi (tuning curve) gösterilmektedir.

Bu teknikte gösterilen cerrahi işlem ve boya enjeksiyonu, uygun şekilde uygulandığında uzmanlaşmış kişiler tarafından bir saat içinde tamamlanabilir ve kayıtlar boya enjeksiyonundan iki ila üç saat sonra başlatılabilir. Bu prosedürü uygularken, işlem sonrası deney hayvanının sağlık durumunun dikkatle izlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Daha derin beyin yapılarındaki nöronlardan kayıt almak için iki foton görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış bir nöron popülasyonundan tekil ünite yanıtlarının nasıl etiketleneceği ve kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.