Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerle kaplanmış bir mikroakışkan cihaz oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan kalıbın imal edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise PDMS kanalın oluşturulmasıdır.

Ardından, endotel hücreler cihazın içine ekilir. Son adım, hücrelerin cihaz içerisinde kültüre edilmesidir. Nihai olarak, endotel hücre kaplı mikroakışkan cihazlar, in vitro ortamda hücreden hücreye etkileşimleri göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, araştırmacıya biyolojik ve biyofiziksel koşullar üzerinde sıkı kontroller sağlaması ve floresan mikroskopi ile uyumlu olmasıdır. Bu yöntem, hematolojik hastalıklardaki biyofiziksel hücre-hücre etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, lökosit biyolojisi, kanser metastazı ve hematopoetik kök hücre biyolojisi gibi fenomenlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, başarılı hücre yerleşimi için koşulların sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiği nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Fabrikasyon hazırlığı kapsamında, mikroakışkan cihazın bilgisayar destekli tasarım görüntüsü harici bir maske tedarikçisine gönderilerek bir fotomaske oluşturulur. Teslim alındığında maske, soda kireç cam üzerindeki bir krom tabakadan oluşur. Burada mikroakışkan kanal genişliği 30 mikron'dur.

Mikroakışkan cihazın üretimine başlamak için, çıplak bir silikon gofret piranha çözeltisi ile 15 dakika boyunca temizleyin, ardından 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Daha sonra silikon gofreti 30 saniye boyunca hidrofluorik asit içerisinde bekletin ve yaklaşık 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Ardından, bir spin kaplayıcı kullanarak, 3000 rpm dönüş hızıyla gofret üzerine 30 mikron yüksekliğinde MicroChem SU-8 2025 fotoresist kaplayın.

Fazla çözücüyü uzaklaştırmak için SU 8 20 25 kaplı wafer'ı 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerinde beş dakika bekletin. Bu adım için fırın kullanılması önerilmez. Ardından, fotomaskeyi wafer'ın üzerine yerleştirin ve SU 8 20 25 fotoresistin çapraz bağlanmasını sağlamak için bir maske hizalayıcıda UV ışığına maruz bırakın.

Çapraz bağlanma işleminden sonra, SU 8 20 25 fotoresistin polimerizasyonunu daha da hızlandırmak için wafer'ı beş dakika daha 95 °C sıcaklıktaki sıcak plakaya yerleştirin. Ardından wafer'ı, temel olarak P-G-M-E-A'den oluşan SU sekiz geliştiricide dört dakika boyunca bekletin.

Bu işlem, çapraz bağlanmamış SU 8 20 25 fotoresistlerini uzaklaştıracaktır. Yeni geliştirilen wafer'ı 10 saniye boyunca %100 izopropil alkol ile durulayın, ardından basınçlı nitrojen kullanarak veya solventin temiz bir çeker ocak içerisinde birkaç dakika boyunca wafer üzerinden buharlaşmasını sağlayarak kurulayın. Şimdi, bantları wafer'ın kenarlarına yerleştirmeye dikkat ederek, kurulanmış wafer'ı Petri kabının merkezine bantlayın.

Son olarak, wafer üzerine 500 µL sigma coat pipetleyin. Petri kabını kapağıyla kapatın ve ardından wafer'ın tamamen kaplandığından emin olmak için kabı dairesel hareketlerle sallayın. Kapağı kaldırın ve solventin tamamı buharlaşana kadar wafer'ın birkaç dakika boyunca kurumasını bekleyin.

PDMS polimeri ve kürleme ajanı 10'a 1 ağırlıkça oranında karıştırıldıktan sonra, mevcut vakum sisteminin gücüne bağlı olarak birkaç dakika ile bir saat arasında vakumlu desikatör kullanarak hava kabarcıkları giderin. Tüm hava kabarcıkları giderildikten sonra, wafer ve kabın yüzeyi kapanacak şekilde karışımı kaba dökün. Yaklaşık beş milimetre kalınlığında bir PDMS tabakası oluşturun.

Ayrıca bir milimetre kalınlığında, özelliği olmayan ince bir PDMS parçası oluşturun. Ardından karışımı 60 °C'lik bir fırında gece boyunca kürleyin. Ertesi gün, bir bıçak veya neşter kullanarak goferin etrafından kesin ve birden fazla PDMS mikroakışkan cihazı çıkarın.

Ardından, her bir cihazı ayırmak için tabakayı kesin. PDMS tabakayı, mikroakışkan cihazdan biraz daha büyük olacak şekilde kesin. Şimdi, mikroakışkan cihazda giriş ve çıkış delikleri oluşturmak için bir pin mengene Harris unicorn veya benzeri bir cihaz kullanın.

Ardından, mikroakışkan cihazın ve tabakanın yüzeylerini şeffaf bant kullanarak temizleyin. Daha sonra, mikroakışkan cihazın ve PDMS tabakasının yüzeylerini 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakmak için bir plazma temizleyici kullanın. Oksijen plazması, PDMS'nin açıkta kalan yüzeyinde, fiziksel temas sağlandığında bağ kuran reaktif türler oluşturur.

Ardından, 20 gauge kör uçlu iğne takılmış bir mililitrelik bir şırıngayı, PBS içindeki insan plazmasından elde edilmiş 50 µg/mL Fibronectin ile doldurun ve ardından iğnenin üzerine bir parça tüp yerleştirin. İki tüp arasında sıkı bir geçme oluşturmak için ilk tüp parçasının içine daha ince bir tüp parçası yerleştirin.

Ardından, daha ince olan tüp parçasının diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine bağlayın. Kanalları tamamen fibronektin çözeltisiyle doldurmak ve kanalların ıslak kalmasını sağlamak için çıkış portunda 100 microliter boyutunda küçük bir damla oluşturmak üzere şırıngaya basınç uygulayın. Şimdi, mikroakışkan cihazı 37 °C'de, nemlendirilmiş bir inkübatörde 40 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, PBS ile doldurulmuş yeni bir şırıngayı küt uçlu iğneye bağlayın. Mikroakışkan cihazı PBS ile yıkamak için basınç uygulayın. Endotel büyüme medyumunda %8 dekstran ile mililitre başına 500.000 ile 2 milyon arasında insan göbek kordonu ven endotel hücresi (hve) hazırlayın.

Dekstran eklenmesi, hücrelerin mikroakışkan aygıt içerisinde başarılı bir şekilde yapışma ve kültüre girme olasılığını artırır. Küt uçlu bir iğne ve daha geniş bir tüple donatılmış temiz şırıngayı hücre süspansiyonu ile doldurun ve yaklaşık bir metre uzunluğunda daha uzun bir tüp parçası bağlayın. Herhangi bir bağlantı arasında sızıntıyı önlemek için tüpün sıkıca oturduğundan emin olmak kritik önem taşır.

Sistemin performansını optimize etmek için, şırıngada veya boruların herhangi birinde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak boruları hücre çözeltisiyle doldurun. Bu noktada, sisteme herhangi bir sızıntı girmesini veya kabarcık oluşmasını önlemek kritik öneme sahiptir. Çözelti sızıntısı veya ortamda kabarcık bulunması, endotel hücrelerin başarılı bir şekilde yerleşmesini engelleyecektir.

Tüm hava kabarcıkları giderildiğinde ve boru hattının tamamı hücre süspansiyonu ile doldurulduğunda, şırıngayı pompaya yerleştirin ve diğer ucunu mikroakışkan girişe bağlayın. Şırınga pompası, mikroakışkan cihazla aynı yüksekliğe ayarlanır. Hücrelerin ve medyumun cihaza temas etmeden önce yeterince ısınmasını sağlamak için boru hattının uzun kısmı inkübatör içinde dikkatlice sarılır.

Ardından, hücre süspansiyonu sistemimizde 37 °C ve %5 karbondioksit altında, dakikada 1,23 µL'lik bir hacimsel akış hızıyla iki saat boyunca mikroakışkan cihaza infüze edilir. Dakikada 1,23 µL'lik hacimsel akış hızı, en küçük kanallarda saniyede bir milimetrelik bir orta akış hızına karşılık gelir. Bu, tam kan kullanıldığında söz konusu kanallarda santimetrekare başına bir din değerinde bir duvar kayma gerilimine yaklaşık olarak tekabül eder.

Hücre süspansiyonu infüzyonu tamamlandıktan sonra, aynı şırınga pompasını ve uzun boruyu, daha büyük bir şırınga kullanarak iki ila sekiz gün boyunca dakikada 1,23 microliters hızında taze büyüme medyası infüze etmek için kullanın. Hücre monokatmanı istenen konfluens seviyesine ulaştığında, deney için sisteme kan veya hücre süspansiyonu enjekte edin. Burada, mikro akışkan cihaz endotelyalizasyon öncesindeki haliyle gösterilmiştir.

Vasküler fizyolojiyi taklit eden cihazın boyutunu, ölçeğini ve genel tasarımını göstermek amacıyla mikroakışkan cihaza gıda boyası verilmiştir. Brightfield mikroskopisi, mikroakışkan bir cihazın endotelize olduğunu ortaya koymaktadır. Bu görüntü, açıklanan protokol kullanılarak hücre ekiminden 48 saat sonra elde edilmiştir; optimize edilmiş perfüzyon tekniği, endotel hücrelerin mikroakışkan sistemin tüm iç yüzeyini konfluent şekilde kaplamasına olanak tanır.

Hücre ekiminden sonraki 24 ila 48 saat içinde. Bu konfokal görüntüde gösterildiği üzere, mikro kanallı çip üzerindeki mikrovasküler tümör, orak hücreli anemiye bağlı mikrovasküler obstrüktif olayların çoğunun gerçekleştiği yer olan postkapiller venüllerin 30 mikron boyutuna yakındır. Bu deneyde, sağlıklı hastalardan alınan tam kan, oksijensiz koşullar altında çip üzerindeki bir mikrovasküler sisteme infüze edilir.

Bu film, endotelyal mikroakışkan sistemimizdeki tam kan akışının düzenli, pürüzsüz ve sürekli olduğunu ve mikrokanal tıkanıklığına yol açan alanların bulunmadığını göstermektedir. Burada, orak hücreli anemi hastalarından alınan tam kan, bir çip üzerindeki mikro vaskülarizasyon cihazına infüze edilmektedir. Oksijensiz koşullar altında, birkaç kanalda tam tıkanıklıkların görülmesiyle birlikte kan akışında önemli değişiklikler gözlemlenmektedir.

Bu prosedürü uygularken, tüpler değiştirilirken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat etmek önemlidir. Tamamlanan cihaz floresan mikroskopi ile uyumludur ve geleneksel floresan analizlerine uyarlanabilir. Bu teknik, deneysel hematologların kontrollü bir biyofiziksel ve hemodinamik ortamda tek hücreler kullanarak deneyler gerçekleştirmesinin önünü açmaktadır.

Kabarcık Oluşmamalıdır.