Büyüme Eğrisi ve Plate Count tarafından Kuantum Noktaları ve Bakteriyel Toksisite Tahliller kararlı hale getirilmesi ve Bio-konjugasyon

Bu prosedürün genel amacı, antibiyotiklerle konjuge edilmiş veya edilmemiş nanoparçacıkların antibakteriyel etkilerinin yüksek kapasiteli taramasını gerçekleştirmektir. Burada, bu amacı gerçekleştirmek için poly mix ve B ile konjuge edilmiş kadmiyum tellürid kuantum noktalarının antibakteriyel etkileri test edilmektedir. Kuantum noktaları öncelikle me, kapto propiyonik asit içinde çözünür hale getirilir.

Ardından, kuantum noktaları poly mix ile konjuge edilir ve B, antibiyotik plaklı bakteriler hem antibiyotik konjugeli hem de konjugesiz kuantum noktaları ile işleme tabi tutulur; numunelerin yarısı, kuantum noktalarının eksiton ve reaktif oksijen türleri üretmesini sağlamak amacıyla 30 dakika boyunca 440 nanometre mavi ışık radyasyonuna maruz bırakılarak kuantum noktası tedavilerinin bakteriyel büyüme ve sağkalım üzerindeki etkisi değerlendirilir. Optik yoğunluk okumaları yapılır ve koloni sayımları gerçekleştirilir. Elde edilen veriler, antibiyotik konjugeli kadmiyum tellürür kuantum noktalarının uygulanmasının ardından radyasyon uygulamasının, test edilen koşullar arasında en yüksek öldürme etkilerini sağladığını göstermektedir.

Bu yöntem, kadmiyum tellürür kuantum noktalarının ve bunların polyx in B ile konjugasyonunun E coli büyümesi üzerindeki etkisine dair içgörü sağlayabilse de, çeşitli bakteri suşları üzerinde diğer nanoparçacık türlerine ve antibiyotiklere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır; çünkü fazla MPA kuantum noktalarının agregasyonuna neden olur ve eğer çok küçük bir miktar bile dışarı sızarsa filtreye zarar verirler.

Bugün, antibiyotik konjugeli KE IDE kuantum noktalarının antibakteriyel etkilerini değerlendirmek için bir yöntem gösterecek olsak da; benzer bir yöntem indiyum fosfat, çinko sülfat ve kadmiyum iyodür çinko sülfat gibi diğer kuantum nokta türleri ile de kullanılabilir. Bu prosedüre, bir cam şişe içerisinde 15 µM konsantrasyonunda toluen içinde kadmiyum tellürür veya CDTE kuantum noktaları çözeltisi hazırlayarak başlayın; absorbans spektroskopisi ile optik yoğunluğu veya OD'yi ölçün ve bir pipet kullanarak bu stok çözeltiden 200 µL'yi bir cam şişeye aktarın.

Plastik kullanmayın. Ardından 800 µL toluen, 1 mL 200 mM borat tamponu ve 2 µL 11,5 M MER kapto propiyonik asit veya MPA ekleyin; flakonu kapatın ve 30 ila 60 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Çalkalama işleminden sonra, sulu ve organik çözücü fazlar kendiliğinden ayrılacaktır.

Sulu faz, kuantum noktalarının rengini alacaktır. Tiling katmanını önlemek için bu katmanı uzaklaştırın, ardından kuantum noktaları fazını ayırarak temiz bir şişeye aktarın. Çözünür hale getirilmiş kuantum noktalarını saflaştırmak için onları 500 µL'lik bir santrifüj filtresine aktarın.

100 µL 50 mM borat tamponu ekleyin ve 13 dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini dört kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra, yıkanmış kuantum noktalarını 500 µL borat tamponu içinde süspande edin ve 4 °C'de saklayın.

Bir ila iki hafta boyunca stabil kalacaklardır. Kuantum noktalarının konsantrasyonunu tahmin etmek için absorbans ve emisyon spektrumlarını ölçün. Bu şekil, UV lamba aydınlatması altındaki CDTE kuantum noktalarını ve suyla çözünür hale getirilmeden önceki ve sonraki emisyon spektrumlarını göstermekte olup, ligand değişiminden kaynaklı optik özelliklerde ihmal edilebilir bir değişiklik olduğunu göstermektedir.

Protokolün bu kısmı; yosunlar, ticari kuantum noktaları, metal partikülleri ve daha fazlası dahil olmak üzere, negatif yüklü tüm su solarize nanoparçacıklar için uygulanabilir. Bu örnekte, antibiyotik polimiksin B veya PMB, 30'a bir molar oranında kuantum noktalarına konjuge edilecektir. PMB pozitif yüklüdür ve konjugasyona gerek duymadan kendiliğinden birleşir. Reaktifler PMB ve sudur.

60 µM konsantrasyonda. Her kuyucukta 0,3 mL bakteri bulunan, dörtlü tekrarlar içeren 96 kuyucuklu bir plaka için; bir mikro santrifüj tüpüne 50 mM bor tamponunda 1 µM kuantum noktalarının 100 µL'si eklenerek 200 nM konjugatın 0,5 mL'si ile bu hazırlık yeterli olur.

Ardından, konjugat tüpüne suda hazırlanmış 10 x veya 60 µM PMB antibiyotik çözeltisinden 50 µL ekleyin. Kontrol tüpüne 50 µL su ekleyin. Hacmi 50 mM ATE tamponu ile 0,5 mL'ye tamamlayın. Tüpleri alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve bir saat boyunca rotatöre yerleştirin.

Agregasyon oluşursa, konjugasyonu daha düşük antibiyotik konsantrasyonları ile tekrarlayın. Partiküller agregasyon yapmayana kadar konsantrasyonu kademeli olarak artırarak konjugatları yıkayın. Çözeltileri, çoğu antibiyotik için uygun olan ancak proteinler veya antikorlar için uygun olmayan 10.000 moleküler ağırlık kesimli bir filtreden geçirin.

Son olarak, absorbans veya floresans spektroskopisi, jel elektroforezi veya Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi ile kuantum başına düşen antibiyotik molekül sayısını tahmin edin. Bu şekil, PMB konjugasyonundan önceki kuantum noktalarının tipik absorbans ve emisyon spektrumlarını ve 160 molar eşdeğer PMB eklemesinden sonraki emisyonu göstermektedir.

Karelerle belirtilen PMB oranı ile kuantum nokta emisyon yoğunluğu ve üçgenlerle belirtilen pik dalga boyu konumu arasındaki ilişki burada gösterilmektedir. PMB konsantrasyonu arttıkça, QD emisyon yoğunluğu azalmakta ve bu durum pik emisyon dalga boyunda bir kaymaya neden olmaktadır. Protokolün sonraki bölümü, konjugasyon deneyinden iki gün önceki akşam, antibiyotiğin yarı maksimum inhibe edici konsantrasyonunu veya IC 50 değerini ve kuantum toksisitesini belirlemek için gerçekleştirilir.

Taze bir e coli kolonisinden 10 mililitre LB besiyerine ekim yapın. Ertesi gün, deneyden bir ila iki saat önce, şeffaf bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğunu doldurun. Büyütme besiyeri ile deney plakası burada gösterildiği gibi düzenlenmelidir.

Örnekler üç tekrarlı olarak plaklara ekilmeli ve antibiyotik konsantrasyonları, bakterileri çok az inhibe eden bir konsantrasyon ile tamamını öldüren bir konsantrasyonu içerecek kadar geniş bir aralıkta olmalıdır. Konjugat deneylerinde kullanılacak konsantrasyonlardaki kuantum noktaları içeren tüm kuyucuklar da üç tekrarlı olarak eklenmelidir. Çok kanallı bir pipet kullanarak, uygun kuyucuklara 1 ila 50 µL bakteri kültürü ekleyin.

Konsantrasyon, söz konusu suşun ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olacaktır ve buna göre kalibre edilmesi gerekecektir. Büyümeyi izlemek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve cihazı iki saat boyunca her 10 dakikada bir 600 nanometrede okuma yapacak şekilde ayarlayın. Hücrelerin tamamı 0,1 ila 0,15 OD değerine ulaştığında, plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve kaydı durdurun.

Ardından, kuantum noktalı PMB'yi uygun kuyucuklara ekleyin ve plakanın yarısını üç kopya halinde alüminyum folyo ile kapatın. Daha sonra plakayı, aydınlatılacak tarafı maruz bırakmak için 2,4 milliwatt LED'lerden yapılmış özel bir 440 nanometre lambanın altına 30 dakika boyunca yerleştirin. Işığa maruz bırakma işleminden sonra plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve büyüme hızına bağlı olarak 5 ila 12 saat boyunca her 10 dakikada bir OD 600 değerini kaydedin. Kültürlerin kurumasını önlemek için yazılım kullanarak sıcaklığı mümkünse 32 degrees Celsius'nin altında tutun.

Belirlenen bir zaman noktası için büyüme eğrilerini log konsantrasyonuna karşı grafiğe dökün ve ekranda gösterilen, H'nin hill katsayısı olduğu hill denklemini kullanarak antibiyotiğin IC 50 değerini belirleyin. Y max büyümenin en yüksek noktasıdır ve Y min, tercihen yine bir platoda yer alan sıfır noktasıdır. Kayıt süresinin sonunda, boş kuyucuklar hücrelerin tamamen öldüğünü gösterecektir ve ilaç konsantrasyonu arttıkça hücre yoğunluğunda bir gradyan oluşmalıdır.

Bakteriler, burada gösterildiği gibi S şeklinde büyüme eğrileri sergilemelidir. Maksimum platonun konumu suştan suşa büyük farklılıklar gösterecek ve ayrıca sıcaklığa bağlı olacaktır. Temsili olarak belirli bir zaman noktası seçilebilir ve kuantum noktalarını değerlendirmek için IC 50 değerini vermek amacıyla değerler antibiyotiğin logaritmasına karşı grafiğe dökülebilir.

Toksisite sağkalımı ile kuantum noktaları konsantrasyonunun logaritması da grafik haline getirilebilir, ancak kullanılan konsantrasyonda tek başına kuantum noktalarıyla anlamlı bir bakteriyel öldürme elde edilmesi nadirdir. Kuantum noktalarının ve antibiyotiklerin tek başına toksisitesi belirlendikten sonra, antibiyotiğin toksisitesini belirlemek için aynı protokol uygulanabilir. Konjuge kuantum noktaları gösterilmiştir.

İşte analiz için örnek bir düzen. Konjugatların artan konsantrasyonlarda dörtlü kopya şeklinde test edildiğine dikkat edin; yalnızca bakteri içeren bir kontrol şeridi, yalnızca ilaç içeren bir şerit ve yalnızca kuantum noktaları için örnek kuyucuklar dahil edilmelidir. OD 600 okumaları daha sonra büyüme eğrileri oluşturmak ve önceki gibi IC50 değerlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu şekil, tek başına antibiyotik kadar toksik olan konjugatlara ve daha toksik olan konjugatlara bir örneği göstermektedir. Her bir koşul için koloni oluşturan birim sayısını veya CFU değerini belirlemek için, plak sayımı yapmak üzere işlem görmüş 96 kuyucuklu plakadan bir veya daha fazla kuyucuk seçin. Seçilen bakteriyel örneklerin her birini salin çözeltisi ile seri dilüsyona tabi tutun.

Bunun için uygun kolonlara 180 µL salin solüsyonu pipetleyin. Bakteriyel solüsyondan 20 µL aktarın ve 180 µL salin solüsyonu ile seyrelştirin. Pipet ucunu değiştirip karıştırın ve seyreltilmiş bakteriyel solüsyondan 20 µL'yi 180 µL salin solüsyonuna aktarın.

Bu işlemi altı kez tekrarlayın. Ardından, son altı dilüsyondan her birinden 10 µL alarak dikdörtgen bir auger plakasına damlatın. Dikdörtgen bir plakaya 36 nokta damlatılabilir.

Plakayı 15 dakika boyunca tezgahta kurumaya bırakın, ardından plağı 16 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Mililitre başına koloni oluşturan birimleri belirlemek için kolonileri sayın. Bakteriyel büyüme üzerindeki işlemlerin etkisini belirlemek için koloni sayısını dilüsyon faktörüyle çarpın ve ekilen hacme bölün.

E. coli hücre yoğunluğu OD 600'de ölçülmüştür. Burada, sıfırdan hücrelerin tamamen ölmesine kadar farklı ilaç konsantrasyonları içeren temsili bakteriyel büyüme eğrileri gösterilmektedir. Açık semboller, yanlarında belirtilen konsantrasyonlardaki yalnızca PMB uygulamalarını temsil eder.

Dolu semboller ışınlama uygulanmamış C-D-T-E-P-M-B'yi, yarı dolu semboller ise ışınlama uygulanmış C-D-T-E-P-M-B'yi temsil etmektedir. Işınlama, yalnızca PMB içeren örnekler üzerinde herhangi bir etki yaratmamıştır, bu nedenle netlik sağlamak amacıyla bu eğriler gösterilmemiştir. Burada, ışık etkilerini kontrol etmek amacıyla IC 50 değerlerini belirlemek için 200. dakikadaki büyüme eğrisi değerlerinin log PMB'ye karşı grafikleri ve bu denkleme yapılan uyarlamalar yer almaktadır.

Sadece antibiyotik kullanılarak 30 dakikalık ışık maruziyeti ile bir eğri oluşturulmuştur. Bu şekil, CDTE qd'ler kullanılarak QD konsantrasyonuna karşı 200. dakikadaki bakteriyel sağkalımı göstermektedir. Işık maruziyeti ile birlikte bir miktar toksisite görülmektedir, ancak bu miktar bir IC 50 değeri belirlemek için çok düşüktür.

Bu durum, konjugasyon deneyinde kullanılan konsantrasyonlarda tek başına CDTE'nin toksisitesinin, farklı tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için ihmal edilebilir düzeyde olduğunu göstermektedir; 200 dakika için büyüme eğrisi değerleri grafiğe dökülmüş ve burada gösterildiği gibi daha önce belirtilen denkleme uydurulmuştur. C-D-T-E-P-M-B konjugatları, tek başına PMB'den daha toksikti. Buna karşılık, altın nanopartikül A-U-P-M-B konjugatları, tek başına PMB'ye kıyasla artmış bir toksisite göstermemiştir; böylece tedavilerin bakteriyel sağkalım üzerindeki etkisi belirlenmiştir.

P-M-B-Q-D-P-M-B veya tek başına QD ile 30 dakika boyunca I radyasyonuna maruz bırakılan veya bırakılmayan, ardından dört saat boyunca 32 °C'de inkübe edilen 96 kuyucuklu plakadaki E. coli için koloni oluşturan birim sayısı belirlenmiştir. Her bakteri örneğinin salin solüsyonu ile seri dilüsyonları yapılmış ve 100x ile 10⁷x arası konsantrasyonlardaki çözeltilerin 10 µL'lik hacimleri agar plaklara ekilmiştir. Plaklar 37 °C'de inkübe edilmiş ve 16 saat sonra koloniler sayılmıştır.

Bu örnekte, A ile C arasındaki plaka sütunları, artan konsantrasyonlarda CDTE ile işlem görmüş bakterilerdir. Işınlama uygulanmayan konjugatlar ve D ile F arasındaki sütunlar ise artan konsantrasyonlarda konjugatlarla işlem görmüş bakterilerdir. 30 dakikalık ışınlamanın yanı sıra, dilüsyonlar satırlar boyunca gösterilmektedir.

Veriler, ışınlama sonrası konjugatların, ışınlanmamış konjugatlara kıyasla bakteriyel büyüme üzerinde daha güçlü bir inhibisyona sahip olduğunu göstermektedir. Ca reaktiflerinin son derece toksik olduğunu unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, nanoparçacıkların antibiyotiklerle konjugasyonlu veya konjugasyonsuz hallerinin antibakteriyel etkisinin yüksek çıktılı taramasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.