Su Supramoleküler Polimerlerin Boyut, Şekil ve Stabilite Kontrolü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sudaki süper moleküler dinamik nanopartiküllerin boyutunu, şeklini ve stabilitesini kontrol etmektir. Bu, moleküler yapısı hem çekici hem de itici etkileşimler için kaplanmış, kendi kendine birleşen veya polimerize olan dikrotik amplifikatörlerin tasarımıyla gerçekleştirilir. Bu durum, suda kontrollü küresel şekle sahip, kendi kendine birleşmiş nanopartiküller sağlayan engellenmiş bir büyüme mekanizması ile sonuçlanır.

İkinci adım olarak, sulu çözeltinin tuz konsantrasyonu artırılır; bu durum, disko amfiyin moleküler yapısında kodlanmış olan itici etkileşimleri zayıflatır. Bu işlem, küreden çubuğa geçişi tetikler; bu küreden çubuğa geçişin altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için sıcaklığa bağlı dairesel dikroizm (CD) spektroskopik incelemeler gerçekleştirilir. Ek olarak, bir agregat tipinden diğerine geçişi ölçmek ve görselleştirmek için kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu ve nükleer manyetik rezonans gibi analitik tekniklerin bir kombinasyonu kullanılır; elde edilen sonuçlar, küreden çubuğa geçişin supramoleküler polimerizasyonda artırılmış bir kooperatiflik şeklinde ifade edildiğini göstermektedir.

Bu durum, kısıtlı boyuttaki nanoparçacıklarda anti-kooperatif bir süreçten, bu vakada dinamik nano çubuklar şeklinde çok büyük supramoleküler polimerlere yol açan tam kooperatif bir çekirdeklenme uzama mekanizmasına geçişten kaynaklanmaktadır. CD spektroskopisi, küçük açılı X-ışını saçılımı ve do MR gibi spektroskopik tekniklerin cryo gibi mikroskopik tekniklerle birleştirilmesinin temel avantajı, supramoleküler polimerlerin su içindeki geçişlerinin ölçülmesine ve görselleştirilmesine olanak tanımasıdır. Bu dinamik polimerler; sıcaklık değişimleri, OnX gücü değişimleri veya pH değişimleri gibi harici uyaranlara yanıt verebilirler.

Bu yöntemlerin kombinasyonu geniş bir uygulama alanına sahiptir ve moleküler kimya ile kendi kendine düzenlenen nanomalzemeler alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, küçük moleküler yapı taşlarının kendi kendine düzenlenmesiyle oluşan agregatların boyutları ile temel oluşum mekanizmaları arasındaki korelasyon incelenebilir. Bu metodolojinin etkileri, çok çeşitli biyo nanoteknolojik uygulamalara uzanmaktadır.

Özellikle biyomedikal görüntüleme alanına ve, klinik kullanımda başarıları için agregat stabilitesi, yüksek kontrast ve kendi kendine monte olan kontrast ajanlarının vücuttan atılma yeteneği arasındaki hassas dengenin büyük önem taşıdığı, kendi kendine monte olan nanopartikül kontrast ajanlarının geliştirilmesine ilgi duyuyoruz. Kendi kendine monte olan yapı taşlarının moleküler yapısındaki küçük değişikliklerin, supramoleküler polimerizasyon mekanizmasında temel farklılıklara yol açabileceğini fark ettiğimizde, karakterizasyon tekniklerini birleştirme fikrini ilk kez geliştirdik. Prosedürü, Trovan Teknik Üniversitesi'ndeki cryo 10 tesislerinden sorumlu uzman olan Paul Beaumont uygulamalı olarak gösterecek.

Bu protokole, yazılı protokolde açıklandığı üzere 100 millimolar sitrat tamponunda bir BTA gadolinyum DTPA çözeltisi hazırlayarak başlayın. Bu videoya eşlik eden işlemde, bir santimetrelik UV Q küvetini çözeltiyle doldurun. Küveti, dairesel D kromatografi spektrometresindeki küvet tutucuya yerleştirin.

230 ile 350 nanometre arasında bir CD spektrumu ölçün. Ardından, en yüksek yoğunluktaki CD bandında, dakikada bir kelvin hızla 363'ten 283 kelvine kadar bir CD soğutma eğrisi ölçün. Sonra, BTA gadolinyum DTPA'nın sitrat tamponlu çözeltisine, iki molar sodyum klorür tamponlu çözeltiden aynı hacimde ekleyin.

Bu işlem, iyonik şiddeti bir molar sodyum klorüre yükseltecek ve diskoları yarı konsantrasyona seyreltecektir. İyonik şiddet artışının ardından, iyonik şiddeti artırılmış çözeltiyi 40 saniye boyunca vorteksleyin ve 230 ile 350 nanometre arasında yeniden bir CD spektrumu ölçün. Ardından, en yüksek yoğunluklu CD bandında, dakikada bir kelvin hızla 363'ten 283 kelvine kadar bir CD soğutma eğrisi ölçün.

Ham CD verilerini Origin 8.5'e aktarın. Spektrumlarda, ölçülen en yüksek sıcaklıktaki CD etkisini sıfıra ve en düşük sıcaklıktaki CD etkisini bire eşitleyerek normalizasyon yapın; CD etkisinin büyüklüğü agregasyon derecesi ile orantılı olduğundan, normalize edilmiş CD eğrileri de agregasyon derecesi ile orantılıdır. Normalize edilen veriler, Origin Pro 8.5'teki doğrusal olmayan eğri uydurma seçeneği kullanılarak sıcaklığa bağlı bir kendi kendine montaj (self-assembly) modeli ile fit edilir.

Bu modelde, bir çekirdeklenme ve bir uzama rejimi ayırt edilir. İlk olarak, uzama rejimindeki agregasyon derecesini uydurun. Bu denklemde, T değişken sıcaklığı temsil eder.

PHI N, agregasyon derecesiyle orantılı olan net helisite, HE ise uzamanın moleküler entalpisidir. T TE, kendi kendine montajın termodinamik olarak elverişli hale gelmeye başladığı sıcaklık olan uzama sıcaklığını temsil eder. Normalizasyon faktörü fiat, Phi N'in fiat'e oranının birimi aşmamasını sağlamak için eklenmiştir; bu durum, agregasyon derecesinin aşamayacağı sınırdan kaynaklanmaktadır.

Unity fitting, belirli bir konsantrasyon için moleküllerin kendi kendine birleşmesini karakterize eden uzama entalpisini (jewels per mole cinsinden) ve uzama sıcaklığını (Kelvin cinsinden) elde etmeyi sağlar. Fitting işlemi sırasında, denklem yalnızca uzama rejiminde geçerli olduğu için sadece TE altındaki sıcaklıklardaki agregasyon derecesinin fit edilmesi kısıtlamasına uyun; ilk denklem fit edildikten sonra, nükleasyon rejimi denklemindeki tek bilinmeyen parametre, supramoleküler polimerizasyonun kooperatifliğini tanımlayan aktivasyon sabiti ka'dır. Aktivasyon sabitini bulmak için, nükleasyon rejimindeki TE üzerindeki sıcaklıklar için deneysel olarak bulunan agregasyon derecesini fit edin.

Metinde açıklandığı şekilde elektron mikroskopisi için çözeltileri hazırlayarak başlayın. Kısaca iki tampon çözelti hazırlayın; 100 millimolar sitrat tamponu ve içinde beş molar sodyum klorür çözünmüş 100 millimolar sitrat tamponu. Bir millimolar konsantrasyon elde etmek için hazırlanan tamponların her birinin 0.1 mililitresi içerisinde BTA gadolinium DTPA çözün. Ardından, beş milliamperde 40 saniye boyunca çalışan bir C Resington 2 0 8 karbon kaplama kullanarak quanti foil karbon kaplı bir ızgaraya plazma işlemi uygulayın.

Vitrifikasyon prosedürü, kriyojenik sürecin kritik bir adımıdır çünkü burada üretilen parlak ISIS'in ince bir tabakasının TAM analizi için uygun olmasını sağlar. Vitrifikasyon sırasında sulu çözelti, otomatik bir FEI vitro bot kullanılarak ızgara üzerine uygulanır. Bu işlem; numunenin ızgaraya uygulanmasını, ızgara üzerinde sulu çözeltinin ince bir filmini oluşturmak için fazla sıvının blotlanmasını ve ardından ızgaranın sıvı Etan içine çok hızlı bir şekilde daldırılmasıyla gerçekleştirilen vitrifikasyonu içerir.

Vitrifikasyon sonrası, örneği korumak için işlem görmüş ızgarayı sıvı azota aktarın, ardından örnek ızgarasını manuel olarak yine sıvı azot ile soğutulmuş bir autoloader kasetine yerleştirin. Bir sonraki adım, kaseti TUE cryo Titan TEM otomatik yükleyicisine yerleştirmektir. TUE Cryo Titan, 300 kilovolt değerinde çalışan bir alan emisyon silahı ile donatılmıştır.

TAM görüntülerinin kaydedilmesi deneyim ve hızlı işlem yapmayı gerektirir. Bunun nedeni, yüksek enerjili elektron demetinin görüntüleme sırasında numuneye zarar vermesidir. Görüntüler, kolon sonrası enerji filtresi ile donatılmış bir CCD kamera kullanılarak kaydedin. Gadolinyum oldukça paramanyetik olduğu ve proton sinyallerini bu nedenle önemli ölçüde genişleteceği için, gadolinyumun diamanyetik itriyum ve bir BT atrium çözeltisi ile değiştirildiği farklı bir disk kullanılmıştır.

DTPA hazırlanır. 2.979 g/mol molekül ağırlığındaki BT atrium DTPA'dan, bir milimolar hedef konsantrasyona ulaşmak için kaç miligram gerektiğini hesaplayın. Belirlenen miktardaki BT atrium DTPA'yı, D₂O içindeki 50 milimolar derate edilmiş süksinat tamponunda çözün ve ardından elde edilen çözeltiden 0,6 mililitreyi bir Wilmad LABAs NMR tüpüne pipetleyin.

Numuneyi, Varian marka beş milimetrelik I-D-P-F-G probu ile donatılmış Nova 500 spektrometresindeki bir variant unity'ye yerleştirin. 90 derecelik darbeyi uyarlayıp karıştırma sürelerini buna göre optimize ederek standart proton NMR kaydını aldıktan sonra, metinde tartışılan DOI deneylerini gerçekleştirin. HDO'nun over referans probundaki öz difüzyonu belirlendikten sonra DOI tek atımlı darbe dizisi kullanılır ve numunedeki agregatların difüzyon katsayısı belirlenerek buradan hidrodinamik yarıçap hesaplanabilir.

Son olarak, küresel bir parçacığın difüzyonu için Stokes-Einstein bağıntısını kullanarak agregatların hidrodinamik yarıçaplarını RH hesaplayın. Çevresel gadolinyum DTPA komplekslerinin iyonik karakteri, çekirdeği uzatılmış çubuk benzeri agregatlar oluşturacak şekilde polimerize olan disco monomerlerin tek boyutlu büyümesinde engellenmeye yol açar. Çekici ve itici etkileşimler arasındaki denge, agregatların boyutunu ve şeklini kontrol eder.

Parçacıkların ve çözeltilerin boyutunu ve şeklini belirlemek için güçlü bir teknik, sinkrotron kaynağıdır. Küçük açılı x-ışını saçılması veya SAXS. Gadolinium DTPA, sitrat tampon çözeltisinde çözülmüş ve SAXS profilleri iki farklı konsantrasyonda kaydedilmiştir.

Düşük Q bölgesinde sıfıra yaklaşan bir eğim, agregattaki şekil ve izotropi eksikliğine işaret ederek küresel nesnelerin varlığını düşündürmektedir. Farklı konsantrasyonlarda ölçülen veriler, homojen monodispers bir küresel form faktörü kullanılarak fit edilmiş ve hesaplanan yarıçap alanı 3,2 nanometer olarak bulunmuştur. Monomerik disco, BTA gadolinyum DTPA'nın hesaplanan geometrik yarıçapı 3,0 nanometer'dir; bu durum, kendi kendine düzenlenen nesnelerin küresel şekli ve nanometre boyutu için daha fazla kanıt sağlamak amacıyla, en-boy oranı bire yakın agregatların varlığını göstermektedir.

Proton difüzyon sıralı NMR spektroskopisi gerçekleştirildi. DOI NMR, hidrodinamik yarıçaplarının hesaplanabileceği süper moleküler agregatların difüzyon katsayılarının belirlenmesine olanak tanır. Deuterize süksinat tamponu içindeki agregatlanmış diamanyetik dikroitik amplifiyenin difüzyon katsayısı, Stokes-Einstein ilişkisi aracılığıyla 0.69 × 10⁻¹⁰ m²/s olarak belirlenmiştir.

Küresel boyuttaki ayrı nesneler için 2,9 nanometre değerinde bir hidrodinamik yarıçap hesaplanmıştır. Bu boyut, BTA gadolinyum DTPA için SOX verilerinden elde edilen değerle mükemmel bir uyum göstermektedir. Tek boyutlu yığın uzunluğu üzerindeki başarılı kontrolün daha fazla kanıtı, cryo TEM mikrografları ile elde edilmiştir.

BTA gadolinyum DTPA, 1 mM konsantrasyonda, çapları altı nanometre civarında olan beklenen küresel nesneleri oluşturur; bu durum, so ve DOI ölçümlerinden elde edilen sonuçları doğrulamaktadır. Yüksek iyonik kuvvette, yüksek en-boy oranlı çubuk benzeri supramoleküler polimerlerin oluşumu kryo-TEM mikrograflarında açıkça gözlemlenmiştir. Bu bulgunun en muhtemel açıklaması elektrostatik perdelemedir.

Şekil, yaklaşık altı nanometre çapında küresel bir agregattan, altı nanometre çapında ve birkaç yüz nanometreye kadar uzunlukta olan uzamış çubuklara dönüşür. Artan tuz konsantrasyonu ile BTA Gadolinyum DTPA'nın oda sıcaklığındaki CD spektrumları burada gösterilmiştir. BTA gadolinyum DTPA konsantrasyonu, düşük iyonik güçte 8 × 10⁻³ millimolar ve yüksek iyonik güçte 4 × 10⁻³ millimolar'dır.

CD ölçümleri için önemli ölçüde daha düşük bir konsantrasyon uygulanmasına rağmen, belirgin pamuk etkisi, mikromolar konsantrasyonlarda bile bozulmamış agregatların varlığına işaret etmektedir. Tuz konsantrasyonu artırıldığında CD spektrumunun şekli değişmektedir; bu durum, yığınların çevresindeki itici etkileşimlerin azaldığının ve decosların paketlenmesinin arttığının iyi bir göstergesidir. Ayrıca, aynı çözeltilerin CD soğutma eğrileri, şekil bakımından belirgin farklılıklar göstermektedir.

Agregasyonun başladığı sıcaklık, daha yüksek tuz konsantrasyonlarında daha yüksek sıcaklıklara kaymaktadır. CD etkisindeki daha ani artışla karakterize edilen, giderek artan kooperatif bir mekanizma da belirginleşirken; sıfır molar sodyum klorürdeki soğutma eğrisi, anti kooperatif bir sürece işaret eden bir ISO smik kendi kendine düzenlenme modeli ile en iyi şekilde tanımlanmaktadır. 1,0 molar sodyum klorürdeki soğutma eğrisi, kooperatif bir kendi kendine düzenlenme süreci için tipiktir ve sıfır ile bir molar sodyum klorürde BTA gadolinyum DTPA'nın kendi kendine düzenlenmesinin termodinamik parametrelerini nicelleştiren bir nüklasyon elongasyon modeli ile tanımlanabilir.

Kooperatif bir modelin kullanılması, boyutsuz aktivasyon sabiti olan ka'daki azalmayı açıkça ortaya koymaktadır. KA için daha düşük değerler, kendini düzenleme (self-assembly) sürecinde daha yüksek bir kooperatiflik derecesine işaret eder ve bu durum oldukça uzamış supramoleküler polimerlerin oluşumuyla kendini gösterir. Kriyojenik TEM'de gözlemlendiği üzere, gösterilen deneysel teknikler uygulanırken, incelenen dinamik nanomalzemelerin anlamlı bir genel tanımına yalnızca deneysel yöntemlerin kombinasyonu ile ulaşılabileceğini unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, birleşik deneysel yaklaşımımızın ne kadar geniş bir uygulama alanına sahip olduğunu ve kendi kendine düzenlenen nanomalzemeler ile süper polimerler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına nasıl yardımcı olabileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.