T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPS hücreleri) T lenfositleri üretmek ve bunları karakterize etmektir. IPS hücreleri daha sonra in vitro ortamda bir OP9-DL1 kültür sisteminde farklılaştırılabilir ve ardından rag eksik bir farede in vivo olarak olgunlaştırılabilir. Alternatif olarak, hücreler OT-1 TCR'yi aşırı eksprese edecek şekilde genetik olarak mühendislebilir ve ardından in vivo gelişim için adaptif olarak transfer edilebilir.

Altı haftalık in vivo diferansiyasyonun ardından, farelere intraperitonal yolla EEG seven tümör hücreleri enjekte edilerek challenge uygulanabilir ve ardından iPS kaynaklı T hücrelerinin antijen spesifisitesi değerlendirilebilir. Nihayetinde, iPS hücreleri hem konvansiyonel hem de antijen spesifik T hücrelerine diferansiye olabilir ve bu hücrelerin ikincileri hayvanları tümör challenge'ına karşı koruyabilir. Bu tekniğin etkileri, kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, hastanın minimum miktardaki kan veya deri dokusundan türetilen çok sayıda tümör reaktif T hücresinin üretilmesine olanak tanır. Sıfırıncı günde, %20 FBS içeren alpha MEM ortamında, konfluen bir OP9-DL1 hücre monokatmanına sahip 100 milimetrelik bir kültür kabına 5 × 10⁴ iPS hücresi aktarın. Beşinci günde hücreleri tripsinize edin. Ardından, hücreleri taze bir 100 milimetrelik kültür kabında 30 dakika boyunca 37 °C inkübatörde inkübe ettikten sonra santrifüjleyin. Yüzen hücrelerden 5 × 10⁵ tanesini, %20 FBS içeren alpha MEM ortamı ve fare FLT3 ligandı ile birlikte, OP9-DL1 hücre monokatmanına sahip yeni bir 100 milimetrelik kaba ekleyin. Sekizinci günde, gevşek yapışmış hücreleri nazikçe pipetle aşağı indirin, hücreleri santrifüjleyin ve ardından hücreleri konfluen OP9-DL1 hücreleri ile kaplanmış altı kuyucuklu bir kültür plağının tek bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO₂ ortamında iki hafta daha inkübe edin. 22. günde.

Ayrıştırılmış iPS hücrelerini yeni bir kültür kabında, taze besiyerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, yüzen hücrelerin yaklaşık yarısını alın, hücre kümelerini ayıklamak için 70 µm naylon süzgeçten geçirin ve elde edilen tek hücre süspansiyonunu soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra hücreleri 1,5 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda PBS içinde resüspande edin ve IV enjeksiyondan önce hücreleri buz üzerinde muhafaza edin.

Dört haftalık rag eksik bir fareyi, kuyruk venini genişletmek için bir kızılötesi ışık altına yerleştirin. Ardından, 26,5 gauge iğne takılı bir mililitrelik bir şırıngayı 200 µL hücre süspansiyonu ile doldurun ve hücreleri genişlemiş kuyruk veni aracılığıyla adaptif olarak transfer edin. Üç hafta sonra, adaptif transfer yapılan farenin ötanazyasını onayladıktan sonra, dokuları mekanik olarak parçalayarak lenf düğümlerini ve dalağı çıkarın.

Tek hücre süspansiyonunu CK liziz tamponu ile lize edin ve ardından elde edilen mononükleer hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre yüzey markerları için boyama yaptıktan sonra, sıfırıncı günde hücreleri akış sitometrisi analizi ile değerlendirin; birinci günde, plat E paketleme hücrelerini bir OT one MIDR ile gece boyunca transfekte etmek için gene JAMA transfeksiyon reaktifi kullanın; ikinci günde, 1x10⁶ iPS hücresini %0,1 jelatin ile ön kaplanmış 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin; santrifüjden sonra, plat E hücrelerinden psödovirüs içeren supernatantı toplayın ve potansiyel kontaminantları dışlamak için 0,4 mikronluk bir filtreden geçirin. Hücreleri polybrene varlığında bir saat boyunca 330 ×g'de 32 °C'de transdüse edin.

Transdüksiyon prosedürünü tekrarladıktan sonra, hücreleri aynı sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Dördüncü günde transdükse edilmiş iPS hücrelerini tripsinleyin ve ardından pelletleme işleminden sonra hücreleri taze medyada yeniden süspande ederek önceden kodlanmış ışınlanmış snl 7 6 7 feeder hücreleri üzerine ekini yapın. Transdükse edilmiş hücreler konfluense ulaştığında, GFP ve DS red çift pozitif hücreleri akış sitometrisi ile ayıklayın.

IPS hücrelerinin adoptif transferinden altı hafta sonra, tümör challenge'ının 50. gününde, aynı farenin periton boşluğuna 50 µL EEG seven thoma hücresi enjekte edin. Adoptif transfer yapılan hayvanın dalak ve lenf düğümlerinden CD8 pozitif T hücrelerini ayırmak için Miltenyi Biotec CD8 pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanın. İzole edilen CD8 pozitif T hücrelerini, naif bir C57BL/6J faresinden alınan ışınlanmış SPOC hücreleri ile 1:10 oranında karıştırın ve ko-kültürü 40 saat boyunca 0,5 µmol/mL OVA ile pulse edin.

Ardından, hücrelere dört saat daha felden A ekleyin. Son olarak, hücre popülasyonlarını akış sitometrik analiz ile değerlendirin. Naif bir C 57 black six J faresinden SP sitleri izole ettikten sonra, hücre süspansiyonunu iki gruba ayırın.

CFSE yüksek grubunu mililitre başına beş mikromol CFSE ile işaretleyin ve hücreleri mililitre başına 10 mikrogram ova peptidi ile bir saat boyunca pulse edin; CFSE düşük grubunu ise mililitre başına 0,5 µM CFSE ile işaretleyin ve pulse uygulamayın. 2,5 × 10⁶ CFSE yüksek hücreyi, PBS içerisinde 2,5 × 10⁶ CFSE düşük hücre ile karıştırın. Ardından, hücreleri CFSE ekspresyonu için akış sitometrisi ile analiz edin.

İlgili fareye adaptif transfer yapıldıktan 16 saat sonra; tümör challenge'ının 20. gününde intraperitoneal tümör hücrelerini saymak için. Periton boşluğunu yıkamak amacıyla, 18,5 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga ve soğuk PBS kullanın. Tümör infiltre eden hücrelerin belirlenmesi için geri kazanılan tümör hücrelerini sayın.

Tümör challenge'ının geç bir aşamasında tümörü çıkarın ve ardından tümörü üç parçaya bölün. İlk tümör parçasını bir kriyotüpe yerleştirin ve tüpü kuru buz üzerine koyun. İkinci parçayı derhal formaldehit ile sabitleyin.

Kriyokorunan doku kesitlerini havada kuruttuktan sonra üçüncü parçayı kondisyonlu RPMI 1640 medyumunda muhafaza edin. Sabitlenmiş kesitleri 15 dakika daha havada kuruttuktan sonra soğuk asetonda 15 dakika boyunca sabitleyin. Yıkama işleminin ardından lamları PBS içerisinde beş dakika boyunca yıkayın.

Slaytları nemli bir hazneye yerleştirin ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için doku kesitlerini 30 µL %3 B, SA ve PBS ile 30 dakika boyunca örtün. Ardından bloklama tamponunu kurulayın ve doku kesitlerini, %3 PSA içeren PBS içinde seyreltilmiş 50 µL pe anti TCR RV alpha two antikoru ve fitzy anti ova antikoru karışımı ile nemli haznede iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda slaytları soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve son olarak, tümör infiltre T hücrelerinin akış sitometrik analizi için floresan mikroskobik incelemeden önce kesitleri su bazlı bir montaj medyası ile kapatın.

Tümörü tek hücre süspansiyonu haline getirin. Ardından hücreleri spesifik yüzey belirteçleri açısından analiz edin. IPS hücrelerinin notch ligandı DL1 ile stimülasyonunun T hücrelerine katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için T hücresi belirteçleri olarak CD3 ve TCR beta kullanılmıştır; CD3 pozitif TCR beta pozitif IPS hücre türevli hücrelerde CD4 ve CD8 hücre yüzeyi ekspresyonu değerlendirilmiştir.

Sağdaki, in vitro ortamda iPS hücrelerinden üretilen gün 22 CD3 pozitif TCR $\beta$ pozitif CD4 negatif CD8 pozitif tek pozitif T hücrelerini gösteren nokta grafiğine dikkat ediniz. Ayrıca, önceki şekildeki iPS hücre türevli tek pozitif hücreler, plaka kaplı anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 antikorları ile in vitro stimüle edildiklerinde interlökin 2 ve interferon gama üreterek, iPS hücre türevli T hücrelerinin alıcı farelere adaptif transfer sonrası fonksiyonel olduğunu doğrulamıştır. TCR geni transdükse edilmiş iPS hücrelerinin çoğunluğu, birleştirilmiş lenf nodu ve dalak hücrelerinden elde edilen bu nokta grafiklerinde, interlökin 2 ve interferon gama salgılayarak peptit stimülasyonuna in vitro yanıt veren CD8 pozitif CTL'lere diferansiye olmuştur.

CD8 pozitif V beta 5 pozitif T hücreleri, TCR ile transdüse edilmiş IPS hücrelerinin adoptif transferi yapılan farelerde üretilirken, kontrol transdüksiyonu yapılan farelerde üretilmemiştir. CD8 pozitif V beta 5 pozitif popülasyonlar, interlökin 2 ve interferon gamma üretimi için yapılan hücre içi sitokin boyamasında pozitif sonuç vermiştir; bu durum, gölgeli izotip kontrol histogramlarına kıyasla bu histogramlardaki koyu çizgilerle gösterilerek IPS türevli CTL'lerin fonksiyonel olduğu belirtilmiştir. Bu veriler, IPS hücresi transferinden 10 hafta sonra veya OT-I CTL transferinden bir gün sonra farelere enjekte edilen, her grafikte sağdaki piklerle temsil edilen eptit ile pulse edilmiş CFSE yüksek hücreleri ve soldaki piklerle temsil edilen CFSE düşük kontrol hücrelerini göstermektedir.

Antijen spesifik IPS kaynaklı CTL'ler antijen stimülasyonuna yanıt verdi ve buradaki CFSE yüksek hücrelerin yokluğuyla belirtildiği üzere sitotoksik aktivite sergiledi. OT-1 TCR geni transdükse edilmiş IPS hücreleri C57BL/6 farelere adaptif olarak transfer edildi ve ardından farelere EEG7 tümör hücreleri ile challenge uygulandı; 20. günde periton boşluğundaki tümör hücreleri sayıldı. Kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında, TCR TRANSDÜKSE IPS alan farelerdeki tümör hücre sayılarındaki anlamlı azalmaya dikkat ediniz.

En önemlisi, TCR transduksiyonu yapılmış iPS hücrelerinin adaptif transferi, aşırı reaktif CTL'lerin tümör dokularına infiltrasyonunu tetiklemiş ve hayvanları tümör meydan okumasından korumuştur; bu durum, tümör meydan okumasından 30 ila 35 gün sonra geri kazanılan tümör dokularının şu H&E boyamasında görülmektedir; TCR transduksiyonlu hücreler veya OT-I CTL'leri adaptif olarak transfer edilen farelerden alınan tümörlerde bu durum görülürken, mock enjekte edilenlerde veya kontrollerde görülmemiştir. Transduksiyonlu hücreler, buradaki kırmızı oklarla belirtildiği üzere inflamatuar hücreler tarafından infiltre edilmiştir. Kırmızıyla gösterilen Ova spesifik V$\alpha$2 pozitif CTL'lerin, yeşille gösterilen Ova eksprese eden tümör dokularına infiltre olduğu tespit edilmiştir.

Kontrol gruplarındaki farelerin tümörlerinde bu şekilde daha az tümör infiltre hücre bulunmasına veya hiç bulunmamasına rağmen, tümör dokularından elde edilen tek hücre süspansiyonları, CD sekiz pozitif popülasyona kapıleme (gating) yapıldıktan sonra V alfa iki pozitifliği ve V beta beş pozitifliği yönünden akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. TCR Transdükte edilmiş IPS hücreleri adaptif olarak transfer edilen farelerden alınan tümör dokularının en yüksek düzeyde tümör infiltre hücreleri sergilediğine, kontrol Transdükte IPS alan farelerin tümörlerinde ise ova spesifik CD sekiz pozitif T hücreleri tarafından hiçbir infiltrasyon görülmediğine dikkat ediniz.

Bu videoyu izledikten sonra, iPS hücrelerinden antijene özgü T hücrelerinin nasıl üretileceği ve iPS kaynaklı T hücrelerinin fonksiyonlarının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.