Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rejenerasyon sırasında kök hücre ve progenitör davranışlarını in vivo analiz etmek amacıyla, bir planarya içerisinde sağlıklı kök hücre popülasyonunu, kök hücreleri yok edilmiş dokunun yanına konumlandırmaktır. Bu işlem, daha ileri manipülasyonlar için ışınlanmamış veya önceden ışınlanmış bir planaryanın anestezi altına alınması ve immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, immobilize edilmiş ışınlanmamış planarya kısmen kurşunla zırhlanır ve x-ışınlarına maruz bırakılır; bu işlem, kök hücreleri yok edilmiş dokunun, kök hücrelerce zengin kalmaya devam eden zırhlanmış doku ile yan yana olduğu, yaralanmamış bir planarya üretilmesini sağlar.

Alternatif olarak, izole bir kök hücre popülasyonuna sahip bir canlı üretmek amacıyla, ışınlanmamış bir donörden alınan doku grefti, daha önce ışınlanmış bir konağa nakledilebilir. Kök hücreleri yok edilmiş bir konaktaki sonuçlar, kök hücre belirteç genleri için bütün mount RNA in situ hibridizasyonu ile kök hücreleri yok edilmiş dokuların bitişiğinde izole kök hücre popülasyonlarının bulunduğunu göstermektedir.

Burada açıklanan yöntemler, kök hücre davranışlarını hem transplantasyon paradigması hem de kısmi ışınlama paradigması altında inceleyerek planaryalarda rejenerasyonu daha iyi anlamayı amaçlamaktadır; bu yaklaşımlar, çevre dokuların ve bu kök hücrelerin bulunduğu lokal ortamların, neoblastların veya kök hücrelerin davranışlarını etkileyip etkilemediğini test etmemize olanak tanır. Rejenerasyon süreci boyunca, deneyden bir ila iki ay önce, planaryaları ekteki makaleye uygun şekilde besleyin. Bu demonstrasyonda istenen boyutları elde etmek için, uzunluğu 1 ile 2 cm arasında ve genişliği 2 mm'den fazla olan planaryalar seçilir.

Ardından, kullanımdan üç ila yedi gün önce aç bırakılırlar. Sonrasında, %0,1 ila 0,2 ağırlık/hacim oranında cleone'u parian suyunda çözerek hafif bir lokal anestezik olan Chloro tone çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, doku transplantasyonu için çözeltiyi buz üzerinde soğutun; greft dokusunu kesmek için bir bunsen beki yardımıyla, 0,75 milimetre iç çapındaki bir kılcal tüpü ucundan bir ila iki santimetre uzaklıktan 90 derecelik bir açıyla bükün.

Ardından, konakçıya grefti yerleştirmek için bir delik açmak amacıyla, 0.7 millimeter dış çaplı başka bir kılcal tüpü ucundan bir ila iki santimetre uzaklıktan 90 derecelik bir açıyla bükün. Daha sonra, siyah filtre kağıdını (Watman No. 3), filtre kağıdını, Kim wipe'ı ve sigara sarma kağıdını beraberindeki makalede belirtilen boyutlara göre kesin.

Ardından, modifiye Holt Fers çözeltisini ve Caine satüre Holt Fretter çözeltisini hazırlayın. Her ikisini de 4 °C'ye kadar soğutun. Daha sonra, katlanmış bir Kim wipe'ı bir Paraform karesine sabitleyin.

Numuneyi, bir diseksiyon mikroskobu altında Peltier soğutucu plakasına veya başka bir soğutma cihazına yerleştirin. Ardından Kim wipe'ı soğutulmuş Holt Fretter çözeltisi ile doyurun. Daha sonra Kim wipe üzerine iki adet siyah filtre kağıdı dikdörtgeni yerleştirin.

Şimdi bir Petri kabına bir parça Watman 2 numaralı filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını Holt Fretter çözeltisi ile nemlendirin. Ardından, kısmi ışınlama için kabı buz üzerinde soğutun.

Doku transplantasyonuna benzer şekilde, daha büyük bir kaba daha büyük bir kağıt astar yerleştirin. Filtre kağıdını Holt Fretter çözeltisi ile nemlendirin. Ardından kabı buz üzerinde soğutun.

Bu prosedürde, bir Petri kabını soğutulmuş cleone çözeltisiyle doldurun. Transplantasyon için Planaria'yı pipetle kaba aktarın. Aynı anda sadece bir konakçıyı ve bir donörü anestezi edin.

Kısmi ışınlama için, birçok hayvan aynı anda anestezi altına alınabilir. Ardından, hareketsiz kalana kadar pariaların beş ila 10 dakika boyunca cleone çözeltisinde bekletilmesine izin verin. Pariaları, soğutulmuş Holt Fretter çözeltisi ile dolu bir kaba pipetleyerek durulayın.

Bundan sonra, soğutulmuş Holt fretter çözeltisi ile doyurulmuş siyah filtre kağıtlarının üzerine pipetleyerek plin bölgesini sabitleyin. Ardından, bir pens yardımıyla ventral tarafı aşağıya gelecek şekilde yönlendirin. Şimdi, daha önce hazırlanmış ve üst kaynak X-ışını iradyatörü içerisine sığacak olan, buz kovasındaki soğutulmuş bir Petri kabını yerleştirin.

Siyah filtre kağıtlarını hareket ettirerek anestezi uygulanmış plin alanını bir Petri kabında düzenleyin. Ardından bunları üst kaynak X-ışını ışınlayıcısına aktarın; katot tüpü ile paria arasındaki mesafe minimize edilecek şekilde buz kovasını yerleştirin. Böylece etkili doz hızını maksimize edin.

Ardından, x-ışını dozu için kurşun zırhları paria ile katot tüpü arasına yerleştirin. Zırhlanmamış bölgelerden tamamen kök hücre ablasyonu isteniyorsa, 30 gray veya daha fazlasını uygulayın. X-ışını emisyonunun hemen ardından, paria'yı soğutulmuş paria suyuna aktarın.

Ardından, Parian suyunun oda sıcaklığına gelmesine ve hayvanların siyah filtre kağıdından kendiliğinden ayrılmasına izin verin. Kısmi ışınlama prosedürü artık tamamlanmıştır. Bu prosedürü diseksiyon mikroskobu altında başlatmak için, anestezi uygulanmış konakçı ve donör plin bölgelerini, peltier veya soğutucu plaka üzerinde önceden soğutulmuş olan Kim wipe üzerindeki ayrı dikdörtgen siyah filtrelere yerleştirin.

Donörden greft tıkaçını çıkarmak için 0,75 milimetre iç çaplı bir kapiler tüp kullanın. Ardından, bir pens yardımıyla tıkaçını konakçının uygun bir bölgesine yerleştirin. Sonrasında, konakçıdan bir tıkaç çıkarmak için 0,7 milimetre dış çaplı bir kapiler tüp kullanın.

Ardından grefti deliğe yerleştirin. Dikdörtgen siyah filtre kağıdı üzerindeki transplant edilen konakçıyı daha önce hazırlanan Petri kabına aktarın. Bir parça sarmal kağıdı, Caine ile doyurulmuş Holt Fretter çözeltisi ile ıslatın.

Ardından bunu transplant edilen konakçının üzerine yerleştirin. Sonra, doygun Holter çözeltisi içeren dört parça filtre kağıdını ıslatın ve transplant edilen konakçı çökerse, doygun Holt Fretter çözeltisi içeren dört parça kesilmiş Kim wipe pamuğunu ıslatın. Bunları filtre kağıtlarının üzerine yerleştirin.

Ardından, kapağı kapatın. Petri kabını buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, donör parianı iyileşme ve rejenerasyon için parian suyuna aktarın.

Tüm nakiller tamamlandığında, nakledilen parianı gece boyunca 10 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, onu parian suyu ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Parianın filtre kağıdından kendiliğinden ayrılmasını bekleyin veya bir pens yardımıyla nazikçe çıkarın ve bundan sonra iki ila üç günde bir parian suyunu değiştirin.

Işınlanmış ancak tamamen korumalı kontrol parian örneğinde, ışınlamadan üç gün sonra yapılan bütün monte in situ hibridizasyon, yabani tip parian ile ayırt edilemeyen bir kök hücre dağılımı göstermektedir. Öte yandan, ön ve arka kısımları açıkta bırakılarak yalnızca kısmen korunan parian örneğinde, kök hücrelerin korumasız bölgelerden yok olduğu görülmektedir. Burada, başarıyla transplantasyon yapılmış bir parianın dorsal ve ventral görünümleri yer almaktadır.

Transplantasyondan üç gün sonra, greft hem dorsal hem de ventral yüzeylerde net bir şekilde görülür ve greft-konak arayüzünde karakteristik pigmentleşmemiş doku ile çevrelenmiştir. Ancak, başarısız transplantasyonda transplantasyon bölgesinde görünür greft dokusu bulunmaz. Whole mount in situ hibridizasyon, kök hücrelerin yalnızca greft bölgesinde veya çevresinde olduğunu ortaya koymuş olup, bu durum yöntem uzmanlaşıldığında transplantasyonun başarılı olduğunu göstermektedir.

Her bir transplantasyon beş dakika gibi kısa bir sürede tamamlanabilir. %90 ila %100'e yaklaşan başarı oranlarıyla, kısmi ışınlama işlemi büyük ölçüde ölçeklendirilebilir; bu durum, ışınlayıcınızın alan boyutunun yeterince büyük olduğu varsayıldığında geçerlidir.