Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Bu deney, ekzojen gen ekspresyonunun orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için civciv orta beyninin in ovo elektroporasyonunu göstermektedir. İlk olarak, ekzojen DNA'yı gelişmekte olan orta beyin vezikülüne spesifik olarak hedeflemek amacıyla, hamburger Hamilton evre 11 civciv embriyolarının orta beynine istenen plazmit DNA enjekte edin. Ardından, özel yapım küçük elektrotlar kullanarak, ekzojen DNA'yı spesifik olarak orta beyin nöral progenitörlerine iletmek için orta beyin vezikülüne elektroporasyon uygulayın.

Ardından, orta beyinde iyi M cherry ekspresyonu gösteren 23. evre embriyoları hasat edin ve optimal orta beyin transvers kesitlerini hazırlayın. Sonuç olarak, tirozin hidroksilaz gibi dopaminerjik nöron belirteçleri için yapılan immün boyama analizi, ilgili genlerin ekspresyonu ile indüklenen nöral progenitörlerin olgun dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını gösterebilir. Bu tekniğin mevcut diğer in ovo elektroporasyon yöntemlerine göre temel avantajı, mirin dopaminerjik nöron farklılaşmasını incelemek için membran spesifik elektroporasyon sağlayabilmesidir.

Bu yöntem orta beyin gelişimi hakkında bilgi sağlayabilse de, kader haritalama analizi yapmak ve gen ekspresyonunun düzenlenmesini incelemek amacıyla sinir sisteminin diğer bölümlerine de uygulanabilir. Hamburger-Hamilton evre 11 embriyoları elde etmek için, her döllenmiş yumurtayı yan tarafına konumlandırın ve üst kısmını kurşun kalemle işaretleyin. Ardından tepsileri, önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir inkübatördeki sallayıcıya yerleştirin.

Döllenmeden 41 saat sonra, her 24 saatte bir nemi ve su seviyesini kontrol edin. Yumurtaları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın. Her bir yumurtanın yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve kurulayın.

Şimdi, kalemle çizilen çizginin üzerine büyük bir dikdörtgen oluşturacak şekilde iki adet dört santimetrelik şeffaf bandı bir yumurtaya yan yana yerleştirin. Bandı yumurtaya iyice yapıştırarak, 18 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga ile pencereyi çerçeveleyin. Embriyoyu rahatsız etmemek veya ona zarar vermemek için iğneyi sarıdan uzağa doğru eğerek yumurta kabuğunu delin.

Yumurtadan beş mililitre albümin çekin. İğneyi %70 ethanol ile temizleyin. Bir sonraki yumurtayı delmeden önce iğneyi kurulayın.

Alevli kahverengi mikro pipet çekicisi için ayarları girin. Ardından, ince duvarlı kapiler tüpleri P 10 pipet kullanarak enjeksiyon iğnelerine dönüştürün. Uzun uçlu bir kapiler pipet ucuna 5 ila 10 µL plazmid çözeltisi çekin.

Ardından, cam iğneyi hava kabarcığı içermeyen sürekli bir sütun halinde yavaşça doldurun. Doldurulmuş iğneyi mikro manipülatöre ve mikro enjektöre bağlı olan iğne tutucusuna yerleştirin. Şimdi, iğneyi daha iyi görebilmek için karanlık bir arka plan kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında, yeşil sıvının durduğu noktadan yaylı makasla iğneyi kesin.

Önceki iğne deliğinden iki ila iki buçuk santimetre çapında bir pencere kesin. Albümini çekmek içindir. Kesme işlemi sırasında yumurtayı bir elinizde döndürün.

Yumurtalar arasında makasları %70 etanol ile doyurulmuş bir kim wipe ile temizlemeyi unutmayın. Civciv embriyosunu bir diseksiyon mikroskobu altında incelemeye geçin. Gerekiyorsa, civciv embriyosunun altına PBS içinde 0,22 mikrometre filtrelenmiş %20 Hindistan mürekkebi enjekte ederek embriyoyu görünür hale getirin. Embriyoyu, başı iğneden uzak olacak şekilde, iğnenin yoluna paralel olarak konumlandırın.

Neural tüpü, orta beyin ile arka beyin birleşim noktasından 45 derecelik bir açıyla yavaşça delin. Süresi 25 milisaniyeye ayarlanmış pico spritzer mikro enjektörler ile enjekte etmeye başlayın. İğnenin ucuna bağlı olarak süreyi ayarlayın ve sadece orta beyni temsil eden neural vezikülü fast green boyası içeren plazmid DNA ile doldurun.

Enjeksiyon iğnesini geri çektikten sonra, embriyonun üzerine üç damla pen strep solüsyonu damlatın. Verimli elektroporasyon için B-T-X-E-M-C eight 30 elektroporatörünün ayarlarını doğrulayın. Ventral orta beyin pozisyonunda, özel yapım küçük L şeklinde platin elektrotları, embriyonik orta beyin iki elektrodun arasında merkezlenecek şekilde, nöral tüpün altı ile aynı yatay seviyeye yerleştirin.

BTX ayak anahtarına bir kez basın ve elektrotların etrafında oluşan hava kabarcıklarını gözlemleyin. Her başarılı elektroporasyondan sonra elektrotları yumurtadan dikkatlice çıkarın ve elektrotları silin. %70 etanol ile ıslatılmış bir kimyasal temizleme bezi kullanarak, embriyo üzerine üç damla daha penisilin-streptomisin çözeltisi damlatın.

Şimdi pencereyi beş santimetreye beş santimetrelik şeffaf paketleme bandı ile kapatın. Yumurta içeriğine dokunmadan yumurtayı iyice mühürleyin ve yumurtaları, döner tablalar kapalıyken tekrar inkübatöre yerleştirin. İstenilen evreye ulaşıldığında, yaşayan embriyoları her bir koşul için PBS dolu ortak bir Petri kabına toplayın.

Ardından, floresan diseksiyon mikroskobu kullanılır. Toplanan embriyolar m cherry ekspresyonu açısından taranır ve pozitif embriyolar 24 kuyucuklu bir plağın ayrı kuyucuklarına aktarılır. Her kuyucuğa taze hazırlanmış 1 mL %2 paraformaldehit eklenir ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edilir.

Fikse edilmiş embriyoları 3 kez PBS ile yıkayın; embriyolar dengeye gelip senkronize olana kadar %15 sakkaroz içinde bekletin. Dengeleme işlemini %30 sakkaroz ile tekrarlayın, ardından her bir embriyoyu OCT içine gömün; sonraki analizler için optimal orta beyin enine kesitleri elde edebilmek amacıyla embriyoları uygun şekilde yönlendirin.

Embriyonik civciv orta beyin ovo elektroporasyon deneyi hh'de, aşağı yönlü analizler için kalın orta beyinden 18 mikron kalınlığında kriyostat kesitleri hazırlayın. Evre 11 civciv embriyolarına, m cherry floresan belirteç ve ilgi duyulan genlerden oluşan bir plazmid kokteyli ile enjeksiyon sürecini takip etmek için fast green boyalı bir izleyici enjekte edilir. Orta beyin elektroporasyonundan sonra embriyolar inkübasyona devam ettirilir ve m cherry pozitif embriyolar toplanıp, fikse edilip gömülür.

Ardından orta beyin kriyoseksiyonları hazırlanır. Başarıyla enjeksiyon yapılan ve elektropore edilen civciv embriyoları, tirozin hidroksilaz gibi orta beyin belirteçleri ile immün boyama yöntemiyle analiz edilir. M cherry ekspresyonu, enjeksiyon belirteci olarak kullanıldığında, gelişimin devamını takiben tipik olarak orta beyin bölgesinde görünür hale gelir.

Uygun m cherry ekspresyonu sergileyen embriyolar daha sonra fikse edilir, gömülür ve orta beyin kriyoseksiyonlarını hazırlamak için yönlendirilir. Burada, elektropore edilmiş nöral progenitorlerde dopaminerjik kaderin belirlenmesi, m cherry ve flag etiketli genin dopaminerjik nöron markörü tirozin hidroksilaz ile kolokalizasyonu aracılığıyla incelenir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA konstrüktlarının spesifik olarak orta beyin bölgesine nasıl enjekte edileceği ve bu prosedürü takiben küçük, özel yapım elektrotlar kullanılarak elektroporasyonun nasıl noktasal olarak gerçekleştirileceği dahil olmak üzere, gen ekspresyonunun embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron progenitorlerine bölgesel olarak nasıl kısıtlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

RNI aracılı kilitleme veya rapor genlerine bağlı güçlendiricilerin ekspresyonu gibi diğer yöntemler, sinir sisteminin spesifik bölgelerinde ve hücre tiplerinde gen fonksiyonunu ve gen düzenlemesini incelemek için kullanılabilir.