Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması

Merhaba, ben Christine Beaton. California Üniversitesi Irvine kampüsündeki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, George Chen'in laboratuvarında araştırma asistanıyım. Önümüzdeki iki gün boyunca size, T hücresi büyüme faktörü anlamına gelen TCGF'nin nasıl hazırlanacağını göstereceğim.

Günlük hücre kültürlerimizde, kültür ortamındaki sitokinlerin bileşimi hakkında kesin bir bilgiye ihtiyaç duymadığımız durumlarda, T hücrelerinin genişlemesine yardımcı olacak gerekli sitokinleri içeren, dalak hücre kültüründen elde edilen bir süpernatant olan T-hücre büyüme faktörünü (TCGF) kullanırız. TCGF'yi hazırlama yöntemimiz şöyledir: Sağlıklı Lewis sıçanları sakrifiye edildiğinde dalaklarını alır, tek hücre süspansiyonu hazırlar, eritroliz yoluyla eritrositlerden kurtulur ve ardından mononükleer hücreleri, T hücrelerini büyümeleri için gerekli tüm sitokinleri üretmeye teşvik edecek olan konkanavalin A ile stimüle ederiz. TCGF üretmek için hücreleri aktive etmemiz gerekir.

İşlem şu şekilde gerçekleşir: Hücre kültürümüze, kısaltılmış adıyla Con A olarak bilinen lectin concanavalin A ekleyeceğiz. Con A'yı hücre kültürümüze eklediğimizde, glikozillenmiş T-hücre reseptör kompleksine bağlanacaktır ve aynı anda birkaç komplekse bağlanarak "capping" (başlık oluşumu) dediğimiz durumu gerçekleştirecektir. Böylece hücre yüzeyindeki tüm reseptörleri agregasyonla bir küme haline getirecek ve bu da T lenfositlerinde bir aktivasyon sinyali oluşumunu tetikleyecektir.

Hücreler aktive olduktan sonra, blastlaşacaklar. Yani büyüyecekler ve ardından sitokinler salgılamaya başlayacaklar. Başlangıçta TCGF'nin temel olarak interlökin 2 olduğunu düşünüyorduk, ancak artık durumun pek öyle olmadığını biliyoruz.

Ayrıca interferon gamma, TNF alfa ve muhtemelen hücreleri kültürde 48 saat sonra hayatta tutmak için gereken çok küçük miktarlarda sitokinler de içerir. Hücreler, ihtiyacımız olan tüm sitokinleri üretmiş durumdadır. Bu nedenle hücreleri uzaklaştıracağız; hücreleri uzaklaştırıp sadece süpernatant kaldığında, süpernatantta hala bir miktar serbest konal bulunacaktır. T-hücre hatlarının büyümesini sağlamak için T-hücre büyüme faktörünü kullanmak istediğimizden, bu durum bir sorun teşkil edecektir.

Ve eğer konvalvalarini orada serbest bırakırsak, hücreleri aktive etmemizi istemediğimiz zamanlarda aktive edecektir. Bu sorunu aşmak için, serbest konvalvalarinlerin tamamına bağlanacak aşırı miktarda bir şeker ekleyeceğiz. Böylece tamamen inaktive olacaklar ve kültüre TCGF eklediğimizde hücrelerdeki diğer glikozillenmiş reseptörlere bağlanmayacaklardır.

Öyleyse başlayalım. Bu deneyin ilk adımı, ötanazi sonrası hemen sıçanlardan dalakları çıkarmaktır. Ben de steril aletler kullanarak bunu hemen gerçekleştireceğim.

Dalakları çıkardıktan sonra, onları antibiyotiklerle takviye edilmiş PBS içine koyacağım; antibiyotik olarak penisilin ve streptomisin kullanıyorum. Öyleyse başlayalım. Kültürümde herhangi bir kontaminasyon oluşmamasını sağlamak için sıçanı %70 etanol ile püskürterek temizliyorum.

Ardından aletlerimi kullanarak buradaki deride küçük bir kesi yapacağım. Sonra kas tabakasını kaldırıyorum ve dalak tam burada beliriyor. Böylece diğer cımbızı alıp dalağı zarar vermeden nazikçe dışarı çıkarıyorum.

Bağ dokusunu bu şekilde temizliyorum. Böylece şu an elimde bir dalak var. Karın boşluğu içindeki başka herhangi bir şeye zarar vermemeye çok dikkat ediyorum; çünkü bağırsaklara gelecek herhangi bir zarar, dalağımın anında kontamine olmasına yol açacaktır.

Ardından, dalağımı PBS ve antibiyotikler içeren bir tüpe transfer edeceğim. Bu tüpü buz üzerinde tutuyorum. Böylece üç sıçandan dalak hasadını tamamlamış oldum.

Şimdi, bu dalaklardan tek hücre süspansiyonu hazırlamaya hazırız. Dalakları aldığım için, 70 mikronluk hücre süzgeçleri kullanarak tek hücre süspansiyonu hazırlamak amacıyla onları bir doku kültürü kabinine getirdim. Dalaklardan tek hücre süspansiyonu elde etmek için birkaç şeye ihtiyacım olacak.

Steril aletlere, bir adet pens ve bir adet makasa ihtiyacım var. Ayrıca Petri kabının içinde steril 1 mL'lik bir şırınganın pistonu bulunuyor. Dalakları, antibiyotikli PBS içerisine yerleştireceğim.

Ve başka bir Petri kabına, 10 mL PBS ve antibiyotik karışımı içerisine 70 mikron hücre süzgeci yerleştirdim. İlk adım, dalakların temiz olduğundan emin olmaktır; çünkü burada görebileceğiniz üzere, hala küçük konnektif doku parçaları mevcut ve bunları temizleyeceğim, çünkü hücre süzgecini çok hızlı bir şekilde tıkayacaklardır. Bunun için, istemediğim kısımları basitçe kesip Petri kabının kapağına atıyorum.

Şu an dalaklar büyük oranda temizlendi, bu yüzden dalakları tek tek alıp hücre süzgecine koyacağım ve küçük parçalara ayıracağım. Ardından üç dalağı da birbirine karıştıracağım. Bir sonraki adım, tek hücreli süspansiyon hazırlamaktır. Her şeyin steril kalmasını istediğim için hücre süzgecine kesinlikle dokunmuyorum ve dalak parçalarını hücre süzgecinin içinden geçirmek için steril 1 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanıyorum.

Hücre ayırıcı cihazın dış kısmında gördüğünüz üzere, tek hücre süspansiyonu hazırlanıyor. İlk döngüde hâlâ bazı küçük dalak parçaları mevcut, ancak ben yine de tek hücre süspansiyonunu almaya başlayacağım. Bunu zaten buz üzerinde muhafaza ettiğim 50 ml'lik bir tüpe aktardım.

Hücre süzgecimi 10 mL daha PBS ve antibiyotik ile yeniden dolduracağım. Bu yüzden, yaklaşık olarak 10 mL daha antibiyotikli PBS alıyorum; sadece yıkama yaptığımız için tam olarak 10 mL olması gerekmiyor. Bunu hücre süzgecine ekliyorum ve ardından aynı prosedürü uyguluyorum.

Şırınga pistonuna geri dönüyorum ve ocid üzerinden biraz daha bastırıyorum. Tabii ki, hücre süzgecinde kalacak olan konjonktif doku ve çıkaramadığım küçük yağ parçaları olduğu için her şeyi tamamen geçiremezsiniz. Ancak, dalağınızın büyük bir kısmını hücre süzgecine aktarmış olmanız gerekir.

Ardından, daha önce yaptıklarımı aynen tekrarlıyorum. Tek hücre süspansiyonumu toplayacağım ve aynı dişe ekleyeceğim. Şu ana kadar hücre eleyicide ekrandan neredeyse hiçbir şey kalmadı ve çıkan PBS çok daha berrak. Sadece bir kez daha yıkayacağım ve şu ana kadar hücrelerin çoğunu çıkarmış olmamız gerekir.

Şu anda PLE sitlerinden oluşan tek hücreli süspansiyonum elimde ve bunları sadece peletlemek için santrifüj edeceğim. Sekiz ila 10 dakika boyunca döndürmek yeterli olacaktır. PLE sitlerimizi santrifüj ettik ve güzel bir pelet elde ettik.

Şimdi yapacağım işlem, süpernatantı uzaklaştırmak ve ardından kırmızı kan hücrelerini liz etmek olacak. Miyositleri süspanse etmek için amonyum klorür kullanacağım. Bu, 0.15 molar amonyum klorür çözeltisidir ve dalak başına 5 mL kullanacağım.

Üç dalak örneğim olduğu için 15 mililitre amonyum klorür kullanacağım ve bu işlemi buz üzerinde gerçekleştireceğim. Eritrositleri parçalamak için pipetle üç dakika boyunca nazikçe yukarı ve aşağı çekeceğim. Tamam, burada daha yüksek pozlamaya sahip olan bu çekimi kullanalım.

Böylece elektrositleri üç dakika boyunca analiz etmiş oldum. Şimdi tüpümü PBS ile dolduracağım; alternatif olarak besiyeri de kullanabilirsiniz. Bu işlem, çözeltinin ozmolaritesini hücreler için normal aralığa geri getirmek içindir.

Hücreleri çöktürmek için daha önce yaptığım gibi 8 ila 10 dakika boyunca santrifüj edeceğim. Ardından, antibiyotikli aynı PBS'yi kullanarak onları iki kez yıkayacağım. Şimdi, eritrositleri hemoliz ettikten sonra hücreleri santrifüj ediyoruz; eritrositlerin yüzde yüz oranında salınmadığına dair endişe duymayın.

Böylece pelet hâlâ kırmızı olacak, ancak süpernatant daha berraklaşacaktır. Şimdi süpernatantı boşaltacağım, peleti çözeceğim, 50 ml'ye tamamlayacak kadar PBS ekleyeceğim, santrifüj edeceğim ve iki yıkama yapmış olmak için bu adımı bir kez daha tekrarlayacağım. Ardından sayım yapabileceğim. Miyositleri iki kez yıkadım, ardından onları kültür ortamında süspanse ettim ve sitometre kullanarak saydım.

Beklendiği gibi. Üç daldaktan yaklaşık 600 milyon hücre elde ettim; bir dalağın normalde 200 ila 250 milyon hücre vermesi nedeniyle bu beklenen bir sonuçtur. Bu nedenle şimdi, hücrelerimi %10 fetal calf serum ile desteklenmiş ortamımda mililitre başına 2 milyon olacak şekilde ekim yapacağım.

Hücreleri stimüle etmek için bu ortama 2 µg/mL konsantrasyonda Conc A ekleyeceğim. Ardından hücreleri 48 saat boyunca inkübatörde bekleteceğim. Hücreler şu anda 48 saattir inkübatörde ve size göstereceğim üzere oldukça iyi büyüdüler.

Besiyeri turuncu renge dönüştü. Böylece TCGF hazırlığımızı tamamlamaya hazırız. Hatırlayacağınız üzere, hücreleri aktive etmek için hücre süspansiyonuna kon carnaval eklemiştim.

Yani Concanavalin A bir lektindir. T-hücresinin tüm reseptörlerindeki şekerlere bağlanacak ve tüm bu hücreleri yapay olarak aktive edecektir. Şu an karşılaştığımız sorun, hücre süpernatantında hâlâ bir miktar Concanavalin A bulunmasıdır.

Ve hücreleri genişletmek için diğer T hücresi kültürlerinde snat kullanacağımızdan, bu hücre kültürlerinde con carnaval in a bulunmasını istemiyoruz. Bu nedenle, ondan kurtulmak için con naval in a'nın bağlandığı aşırı miktarda bir şeker ekleyeceğim; bu da burada gösterilen methyl alpha D cyte'dır. Bu şekerden aşırı miktarda ekleyip tamamen çözeceğim.

Geriye kalan tüm konkanaval'a bağlanacaktır ve bu işlem tamamlandığında, hücre süpernatantlarımı steril filtreleyip önümüzdeki birkaç hafta veya ay boyunca kullanmak üzere tüm sıvıları donduracağım. Öyleyse bu son adım için başlayalım. Hücrelerden kurtulmak için santrifüj edebilmek amacıyla hücre kültürü süpernatantımı 50 ml'lik tüplere ekliyorum.

Bu nedenle, gerekli sayıda tüpü dolduruyorum ve bunu kültür kabininde yapmıyorum; yapabilirdim ancak şeker eklediğim için solüsyonumu sonunda herhangi bir şekilde filtrelemem gerekecek, şeker steril değildir, bu yüzden bunu doğrudan tezgahta yapıyorum. Bu şekilde daha kolay oluyor. Şu anda tüm hücrelerimi ve süpernatantı 50 ml'lik falcon tüplerine aktardım.

Şimdi onları santrifüje götüreceğim ve yaklaşık 10 dakika boyunca döndüreceğim. Döndürmenin tek nedeni, hücreleri çöktürerek berrak süpernatantlar elde etmektir. Hücreler şu an çöktürülmüş durumda, dolayısıyla süpernatant berrak ve toplamak istediğim şey buydu.

Şimdi tüm süpernatanı temiz bir 150 santimetrekarelik erlene toplayacağım. Bu erlene şekeri ekleyeceğim. Hücreler çöktürülürken, süpernatan başına 15 mg/ml eklemek için yeterli miktarda şekeri tarttım.

Tamamen çözünmesini bekleyeceğim ve ardından süpernatantımı steril filtreleyeceğim. Şimdi süpernatantın ml başına 15 miligram şeker ekleyeceğim. Kapağı geri kapatıyorum ve steril koşullar altında çalışmadığım için kapağa gelmesinin bir önemi yok, bu yüzden tüm şeker çözünene kadar karıştırıyorum.

Bu işlem oldukça hızlı sürecektir. Evet, şekerin tamamı şu an çözünmüş durumda. Bu yüzden tek yapmam gereken, süpernatantı steril filtreyle süzmek ve ardından alikotlara ayırmaktır.

Normalde -20 °C'de sakladığım 10 ila 15 µL'lik alikotlar hazırlarım. Bu tür alikotlar birkaç ay boyunca saklanabilir. TCGF'yi buzdolabında da saklayabilirsiniz, ancak bu durumda önümüzdeki 10 ila 15 gün içinde kullanmanızı öneririm.

Son iki gün boyunca size T-hücre büyüme faktörünün nasıl hazırlanacağını gösterdim; bu süpernatantın hazırlanması oldukça basittir ve maliyeti çok düşüktür. Bu nedenle, pahalı sitokin kokteylleri satın almak zorunda kalmadan T-hücre hatlarımızı kültürde tutmak için laboratuvarda bunu çok sık kullanıyoruz. Deneylerinizde başarılar dilerim.