Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, homojenize edilmiş ölümsüzleştirilmiş beyin endotel hücresi kültürü elde etmektir. Bu işlem, öncelikle neonatal farelerden beyinlerin izole edilmesi ve tek hücre süspansiyonu elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin polyoma middle T antijeni ile ölümsüzleştirilmesidir.

Ardından hücreler, homojen bir endotelyal tek tabaka oluşana kadar yaklaşık dört hafta boyunca büyütülür. Son adım, yeni hücre hattının immün boyama, Western blot ve Q-Q-P-C-R gibi teknikler kullanılarak karakterize edilmesidir. Bu tekniğin etkileri, preklinik tedavi değerlendirmeleri yapılabildiği ve patofizyoloji hakkında bilgiler elde edilebildiği için nöroinflamatuar veya iskemik beyin bozukluklarının tedavisine kadar uzanmaktadır.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Elaine Salvador uygulamalı olarak gösterecektir. Buffer A içeren bir Petri kabına aktarılan üç ila beş günlük neonatal bir fareden beyin çıkarıldıktan sonra, laminer akışlı kabinde çalışırken her bir preparasyon için beş ila 10 fare beynine ihtiyaç duyulur. Her beyinden serebellumu, beyin sapını, meningesleri ve kapiler fragmanları temizleyin.

Ardından serebrumları, tampon A içeren ikinci bir Petri kabına aktarın. Serebrumları küçük parçalara ayırmak için steril bir skalpel kullanın ve ardından topaklanma kalmayana kadar dokuyu ve tamponu aspire edip dışarı atmak için 10 milliliter pipet kullanın. Bu aşamada, beyin dokusunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g hızında santrifüj ettikten sonra süspansiyonu 50 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantı atın ve peleti 4,5 milliliters tampon A ile 1,5 milliliters %0,75 w/v çözeltide çözün.

Kollajenaz ekleyin. Dokuyu ve kollajenaz çözeltisini, ara ara çalkalayarak 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin. Bu sırada, 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunu 0,1 mg/mL'lik steril bir çözelti ile kaplayarak doku kültürü plakalarını hazırlayın.

Kollajen ve 50 millimolar asetik asit, kollajenin oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyucuklara yapışmasını sağlar. 45 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, 15 milliliters buffer A ekleyerek beyin dokusunun sindirimini durdurun ve peleti bu çözelti içinde tamamen süspande edin. Ardından 250 times G hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın.

Hazırlıktan miyelin tabakasını uzaklaştırmak için dokuya 10 ml steril, ağırlık/hacimce %25 B, s, A ve PBS ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 1000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve ardından peleti 15 ml tampon A içerisinde çözerek taze bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne aktarın; oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 ×g'de tekrar santrifüjleyin. Bu sırada, kollajen IV kaplı plakayı PBS ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, kuyucuklardan ikisini boş bırakın ve diğer iki kuyucuğa iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Süpernatantı attıktan sonra, ağırlıklı olarak endotel hücrelerden oluşan hücre peletini, mililitre başına dört mikrogram puramycin içeren dört mililitre büyüme ortamında yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunun ikişer mililitresini, kolajen kaplı iki boş kuyucuğun her birine ekleyerek, hızlıca yapışan endotel dışı hücreleri öldürmek için 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Ardından, hücre içermeyen iki kuyucuktaki büyüme ortamını aspire ederek atın.

Ardından, endotel hücre fraksiyonunu içeren, yapışmamış hücrelerin bulunduğu besiyerini bu iki kuyucuğa aktarın. Önceki kuyucukları iki mililitre taze besiyeri ile yeniden doldurun. Bu kuyucuklar fibroblastlar ve astrositler gibi diğer hücre tiplerini içerir; bunlar paralel olarak büyütülebilir ve morfoloji karşılaştırmaları için kullanılabilir.

Hücreleri ertesi güne kadar doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Poliyoma orta T onkogenine sahip replikasyon yeteneği olmayan bir virüs salgılayan GPE neo fibroblastlarını, GPE neo med içeren jelatin kaplı flasklar içerisinde taze besiyeri ile değiştirerek kültüre edin. Poliyoma orta T onkogeni transfeksiyonu, endotelyal hücrelerin endotelyal olmayan hücrelere göre büyüme avantajı kazanmasını sağlayarak endotelyal morfolojiye sahip homojen bir hücre monokatmanı oluşmasına yol açar. Dört ila altı haftalık kültürden sonra, GPE neo hücreleri ticari olarak mevcut değildir ve paylaşılan kamu materyali olarak temin edilebilir.

GPE Neo Fiberblast hücrelerini 24 saat boyunca büyüttükten sonra, medyadan 10 mililitre çıkarın ve son konsantrasyonu mililitre başına sekiz mikrogram olacak şekilde steril poly brain solüsyonu ekleyin. Hücresel fragmanları uzaklaştırmak için süpernatant karışımı 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin. Ardından, endotel hücre kültürlerindeki medyayı aspire edin ve gece boyunca inkübe ettikten sonra kuyucuklara iki mililitre süpernatant poly brain karışımı ekleyin.

Bu prosedürü ertesi gün, süpernatan poly beyin karışımının taze bir alikotu ile tekrarlayın. Süpernatan poly beyin karışımını uzaklaştırın. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve ardından taze büyüme medyumu ekleyin.

Hücreler konflüent hale gelene kadar her üç günde bir büyüme ortamını değiştirmeye devam edin; ardından hücreleri kolajen ile kaplanmış plakalara bir veya iki kez pasajlayın. Stabil serebral endotelyal hücre hatları tipik olarak dört ila beş haftalık ardışık kültür sonrası elde edilir.

Homojen bir endotel monokatman tüm kuyucuğu doldurduğunda. Stabil hücre hatları elde edildikten sonra, hücreleri kolajen IV kaplı doku kültürü flasklarına aktarın; hücreleri haftada birden fazla olmayacak şekilde, 3 ml tripsin EDTA ile ve hücre tabakası dağılana kadar 37 °C'de 5 ila 15 dakika inkübe ederek tripsinize edin. 5 ml besiyeri ekledikten sonra yeni flasklara ekim yapın, 1:4'ten daha yüksek bir ayırma oranından kaçının.

Konfluent bir T 75 flask elde etmek için yeterli hücre sayısına ulaşıldığında, daha sonraki kullanımlar için hücre kriyotüpler hazırlanabilir. Bunun için hücreleri daha önce olduğu gibi tripsin ile toplayın, ardından hücre süspansiyonunu 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre peletini altı mililitre dondurma ortamında yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonundan 1,5 mililitreyi dört adet kriyotüpe pipetleyin.

Kriyoviyalleri izopropanol ile doldurulmuş bir Nalgene dondurma kabına yerleştirin ve bir gün boyunca -80 °C'de tutun. Son olarak, kriyoviyalleri sıvı azot altında saklayın. Hücrelerin bulunduğu kriyokuadı bir su banyosunda çözdürün ve ardından 10 mL büyüme ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Besiyeri 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutulur ve tüp, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g'de santrifüj edilir. Besiyeri aspire edildikten sonra, pelet uygun hacimdeki büyüme besiyerinde yeniden süspanse edilir. Hücre süspansiyonu, ön ısıtılmış büyüme besiyeri ile birlikte kolajen tip IV kaplı bir T 25 hücre kültür flaskına aktarılır.

Ekim için hücre yoğunluğu mililitre başına en az 1x10⁴ hücre olmalıdır. Ertesi gün ortamı değiştirin ve hücreler yaklaşık beş gün sonra konfluense ulaştığında hücreleri daha önce olduğu gibi pasajlamaya devam edin; hazır olduklarında, sonraki deneyleriniz için istediğiniz yoğunlukta hücre ekimi yapın. C end hücreleri, endotelyal ve kan-beyin bariyeri belirteçlerinin immün boyaması ile karakterize edilmiştir.

Bu görüntü, clain five için immün boyanan C and hücrelerinin morfolojisini göstermektedir. C and hücreleri, büyüme inhibisyonu sergileyen, sıkıca paketlenmiş uzamış hücrelerin tek tabakalarından oluşan beyin ECS primer kültürlerine benzer bir morfolojiye sahiptir. Net konflüans aşamasında, hücreler saptanabilir düzeylerde clain eksprese etmiştir.

Burada C CN hücreleri, occludin antikoru ile immün boyanmıştır. İmmünofloresan boyama ile tekrar gösterildiği üzere, hücre-hücre bağlantılarında lokalize olan VE cadherin proteinlerinin ekspresyonu görülmektedir. Transendotelyal elektriksel direnç, akım geçiren ve voltaj ölçen elektrotlar içeren bir düzenek kullanılarak ölçülmüştür.

Bu şekilden, C end hücrelerinin transendotelyal elektriksel direncinin, kültürdeki gelişiminden sonra zamanla arttığı görülebilir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların bir fare modelinde serebrovasküler bozuklukları incelemesinin önünü açmıştır.