Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer Morfolojisi

Bu yöntem, fungal morfoloji ile üretkenlik arasındaki ilişkiyi saptamak amacıyla, filamentli fungus olan aspergillus Niger'in mikropartikül bağımlı morfolojik yapısını oluşturur ve karakterize eder. Spesifik üretkenliği hesaplamak için sekiz Niger'i, üç litrelik karıştırmalı tank biyoreaktörde mikropartiküllerle veya mikropartiküller olmadan 72 saat boyunca kültüre edin. Belirlenen zaman noktalarında örnekler alın ve biyokütle, kuru ağırlık ve β-fruktosidaz aktivitesini belirleyin.

72 saat sonra, fungal morfolojiyi mikroskopi ile inceleyin ve dijital görüntü analizi ile karakterize edin. Ardından, görüntü analizinin ilgili parametrelerini, spesifik üretkenlik ile matematiksel olarak ilişkili olan bir morfoloji numarasında birleştirin. Sonuç olarak bu yöntem, filamentöz mikroorganizmaların morfojenezini daha iyi anlamak için Aspergillus niger morfolojisini hassas bir şekilde oluşturabilir ve kapsamlı bir şekilde karakterize edebilir.

Aspergillus niger, onlarca yıldır biyoteknolojide önemli bir endüstriyel iş gücü olmuştur. A. niger ve ilgili türlerin en ilgi çekici ve genellikle kontrol edilemeyen özelliklerinden biri, kültür koşullarına bağlı olarak yoğun küresel peletlerden viskoz misellere kadar uzanan karmaşık morfolojileridir. Prosedürümüzün temel avantajı, mikropartiküllerin eklenmesi yoluyla fungal morfolojiyi artık özellikle proses ihtiyaçlarına göre özelleştirebiliyor olmamızdır.

Şu ana kadar, fungal morfolojinin bu şekilde özelleştirilmesi için başka bir yöntem tanımlanmamıştır. Bu yöntem, filamentöz mikroorganizmaların kültivasyonuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çünkü endüstriyel uygulamalar için fungal morfolojiyi kontrol etmek ve ayrıca yüksek verimli bir fungal morfoloji ile düşük verimli olanı birbirinden ayırt etmek kritik öneme sahiptir.

Protokolümüz, fungal morfolojinin istenilen şekilde özelleştirilmesi ve karakterizasyonu için gerekli araçları sağlamaktadır. Bu yöntem, Aspergillus niger morfolojisi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, Penicillium veya Streptomyces suşları gibi diğer filamentli mikroorganizmalara da uygulanabilir. Eşlik eden protokolde detaylandırıldığı üzere, steril kültürler için dört biyoreaktör hazırlayın.

Mikropartikül ilavesine dayanan metin; farklı morfolojilere sahip Aspergillus niger kültürlemesi. 72 saat sonra, 50 mililitre kültür sıvısı örneğini bir Falcon tüpüne aktarın.

Biyokütle örnekleri, desikatörde kurutulduktan sonra en az iki kez paralel olarak alınmalıdır; selüloz filtre mikroskala ile tartın. Filtreyi, su jetli vakum pompasına bağlı bir büchner hunisine yerleştirin; önce 10 mililitre örneği, ardından biyokütleden ortam bileşiklerini uzaklaştırmak için 10 mililitre deiyonize suyu filtreleyin. Filtreyi ortadan bir kez katlayın.

Cam bir petri kabına yerleştirin ve sabit ağırlığa ulaşana kadar kompartıman kurutucuda bekletin. Filtreyi bir desikatöre aktarın ve soğumasını bekleyin. Ardından ağırlığı ölçün.

Glukoz oksidaz ve peroksidaz enzim analizleri için ağırlık hesaplaması, filtre farkı ve ardından örnek hacmine bölünme yoluyla litre başına biyokütle kuru ağırlığını hesaplayın. Örnekleri 1,5 mililitrelik bir şırınga geçişi kullanarak buz üzerinde saklayın. Kültür süspansiyonunu bir selüloz asetat filtre aracılığıyla bir reaksiyon tüpüne aktarmak beta frukto SASE analizini gerçekleştirir.

İstatistiksel sağlamlık için iki üçlü örnek kullanarak başarıyı titizlikle sağlıyoruz. Analize başlamak için test tüpüne 20 µL örnek ekleyin; sakkarozun glikoza parçalanmasının pH ve sıcaklık bağımlılığını kontrol etmek için 20 µL örnek yerine 20 µL deiyonize su kullanın. Ayrıca, her örnek için kültür besiyerindeki kalıntı glikoz miktarına yönelik bir negatif kontrol hazırlayın.

Isı ile inaktive edilmiş numuneden 20 µL. Sukrozdan glikoza reaksiyonu başlatmak için 200 µL 1.65 molar sukroz çözeltisi ekleyin. pH 5.4'te 20 µL numune içeren tüm reaksiyon tüplerini 40 °C'lik bir ısıtma bloğunda 20 dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 95 °C'de 10 dakika ısıtarak reaksiyonu durdurun.

Gerektiğinde örnekleri santrifüjleyin ve ölçülen absorbansın kalibrasyon değer aralığında olması için örnekleri analiz için seyreltin. Ardından, her reaksiyon için bir mikrotitrasyon plağına iki µL örnek ekleyin. Örnek ölçümlerini üç paralel (triplicate) olarak gerçekleştirin.

Ayrıca, 1 mM ile 15 mM arasında değişen 10 glukoz çözeltisi için bir standart eğri hazırlayın. Sıfır noktası kalibrasyonu için 2 µL deiyonize su kullanın. Ardından, her birine 200 µL reaktif çözeltisi ekleyin.

Kuyucuklar oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. Absorpsiyon, 96 kuyucuklu bir sunrise Mikroplaka okuyucu ve Magellan veri geri çağırma yazılımı kullanılarak 450 nanometrede ölçülür. Sonuç grafiği bir hesap tablosuyla açılır ve bir standart eğri kalibrasyon hattı oluşturulur.

Her bir örnek için aktiviteyi hesaplayın. Ardından, uygun negatif kontrol değerlerini örnek aktivitesinden çıkararak beta fruktosidaz aktivitesini belirleyin. Son olarak, biyokütle kuru ağırlığını ve beta fruktosidaz aktivitesini hesaba katarak spesifik üretkenliği hesaplayın.

Üç mililitre kültür süspansiyonunu plastik bir Petri kabına yerleştirin ve morfolojik yapıları ayırmak için fizyolojik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltin. Mikroskobik görüntülerin kalitesi olağanüstü öneme sahiptir. Sonraki görüntü analizi için seyreltme aşamasında dikkatli olunmalıdır.

Petri kabını, entegre kamerası bulunan bir mikroskobun altına yerleştirin. Her görüntüde en az bir nesnenin tamamen yer aldığından emin olarak, örnek başına morfolojik yapılara ait yaklaşık 100 görüntü elde edin ve kaydedin. Farklı reaktörlerden gelen örnekleri içeren kaplarla, her seferinde yeni görüntüler elde ederek aynı şekilde devam edin.

Farklı miktarlarda talk pudrası eklenerek büyütülen farklı reaktörlerden alınan örneklerin farklı morfolojik büyüme formlarını not edin. Ardından, aynı örneğe ait tüm görüntüleri görüntü işleme programı Image J'de açın. İşlem aracını kullanarak görüntüyü binary (ikili) hale getirin.

Komutu bir görüntü serisinin tamamına uygulamak için görüntüleri siyah beyaz hale getirin. Ardından bir makro kodu kullanın ve ölçek çubuğu içeren resimlerden birini açın. 2000 mikrona karşılık gelen piksel sayısını belirlemek için ölçek çubuğu boyunca düz bir çizgi çizin.

Analiz aracını seçin, ölçümü ayarlayın ve şekil faktörleri, feret çapı, alan ve çevre seçeneklerini belirleyin. Bir dizi görüntüyü işlemek için bir makro kodu kullanın. Şimdi, şekil faktörü değerlerinin sonuçlarını tabloya döken hesap çizelgesini açın.

Her görüntü için, tek bir örneğe ait tüm görüntülerle birlikte her bir görüntü için bir morfoloji sayısı hesaplayın. Morfoloji sayısı için ortalama değeri hesaplayın. Morfoloji sayısı ile spesifik üretkenliği grafiklemek için bir grafikleme ve veri analiz programı kullanın.

Artan konsantrasyonlarda talk mikropartiküllerinin eklenmesi yoluyla matematiksel regresyon ile matematiksel ilişkiyi belirleyin. Sekiz Niger SKAN 10 15. Standart koşullarda beklenen pelet morfolojisi sergilenirken, morfoloji gerçek bir pelet morfolojisinden dağılmış veya hatta misel morfolojisine dönüşmüştür.

İlginç bir şekilde, miselyal morfoloji, besiyerinin litre başına 10 gram talk mikropartikülleri ile takviye edilmesiyle oluşturulur. Eş zamanlı olarak, Beto Frukto tase aktivitesi yaklaşık üç kat artar; litre başına bir veya üç gram talk tozu takviyesi, otomatik görüntü analizi ile belirlenen parametreler kullanıldığında, fruktoz aktivitesinin iki katına çıktığı yaygın bir morfolojiye yol açar. Mikropartiküle bağlı morfoloji, morfoloji ile kapsamlı bir şekilde tanımlanabilir.

Not düşülsün ki, pürüzsüz peletler halindeki tam yuvarlak parçacıklar mikroskobik görüntülerde mükemmel daireler olarak görünür. Morfoloji sayısı, standart koşullarda bire yaklaşan bir değere sahiptir. Birinci reaktördeki morfoloji, 0,8 civarında bir morfoloji sayısı sergilemektedir.

Litre başına 10 gram talk pudrası içeren dördüncü reaktördeki morfoloji. Morfoloji sayısı 0,1 civarındadır. Litre başına bir ve üç gram talk pudrası konsantrasyonlarına sahip ikinci ve üçüncü reaktörler için morfoloji sayısı ise bu uç değerler arasında yer alarak dağılmış bir morfoloji sergilemektedir.

Mikropartikül bağımlı morfoloji, beta fruktozit üretkenliği ile yakından ilişkili olduğundan, gelişimden sonra morfoloji, sayı ve üretkenlik arasında iyi bir matematiksel korelasyon bulunmaktadır. Bu teknik, biyoteknoloji alanındaki araştırmacıların fungal morfolojiyi ve özellikle bunun üretkenlikle olan ilişkisini daha ayrıntılı incelemesinin önünü açmıştır. Belirli morfolojik fungal çapraz tiplerin ayrıntılı oluşturulmasına yönelik bu prosedürün ardından, filamanlı mikroorganizma kültivasyonlarının diğer önemli yönleri araştırılabilir.

Örneğin, misel morfolojisinin palat morfolojisinden çok daha viskoz olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, sürecin genel verimliliği, istenen ürünün saflaştırılması ve karşılaşılan sorunlar nedeniyle olumsuz etkilenmektedir. Belirlediğimiz morfoloji sayısı; kültür, protoloji ile ilgili modellerin oluşturulmasına yardımcı olacak ve genel olarak fungal morfolojiye dair anlayışımızı geliştirecektir.