Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı bir translasyon sisteminde transle edilen bir mRNA'nın ana translasyonel duraklama bölgelerini tanımlamak ve konumlandırmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili genin bir T7 transkripsiyonel promotör kontrolü altında klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından mRNA transkribe edilir ve saflaştırılır.

Ardından, sentezlenen proteinleri ve yeni oluşan polipeptidleri işaretlemek için mRNA ve radyoaktif amino asitlerin varlığında in vitro translasyon gerçekleştirilir. Son olarak, polizomlar sedimantasyon hızı santrifüjasyonu kullanılarak izole edilir ve izole edilen yeni zincirler jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Nihayetinde, Tristine SDS page ve otoradyografi ile farklı uzunluktaki yeni polipeptidleri gösteren sonuçlar elde edilebilir; bu da ilgili mRNA boyunca duraklama bölgelerinin varlığını belirtir.

Bu tekniğin, mikro kokal çekirdek koruma analizi gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı; son derece basit, hızlı ve verimli olması ve belirli bir hücre içi sistemdeki herhangi bir mRNA boyunca ana translasyon sonrası bölgelerin belirlenmesine ve tanımlanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem; kodon kullanımı, tRNA bolluğu ve/veya mRNA ikincil yapısı gibi faktörlerin translasyon kinetiğini nasıl etkilediği gibi, translasyon ve translasyonel protein katlanması alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca, translasyon kinetiği ile kod translasyon protein katlanma yolundaki temel basamaklar arasındaki ilişkilerin anlaşılmasına daha fazla katkı sağlayabilir.

Bu tekniğin önemi, protein katlanmasının büyük ölçüde ribozom üzerindeki translasyon sırasında ko-translasyonel olarak gerçekleştiğine inanılan in vivo sürecinin anlaşılmasına kadar uzanmaktadır; ancak mevcut çalışma, ticari olarak temin edilen hücre ekstraktı kullanılarak gamma bikristalin proteininin hücre dışı translasyonunu içermektedir. Bu teknik, herhangi bir hücresel kaynaktan hazırlanan translasyon yeteneğine sahip ekstraktlar kullanılarak, potansiyel olarak herhangi bir proteinle ilgili translasyonel IDE'lerin belirlenmesinde de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, protokolün iki temel adımında zorluk yaşayacaklardır.

Birincisi, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunun ribozoma bağlı kalmasını sağlayacak olan translasyon reaksiyonu için gereken toplam sürenin belirlenmesidir. İkincisi ise, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunu ayrıştırmak için uygun bir sistem bulmaktır; sistem seçimi, incelenen proteinin boyutuna bağlıdır. Bu yöntem fikri ilk olarak, seksenli yılların ortalarında, globinin eş zamanlı translasyon-katlanma (COT) önerilen modeliyle ilişkili olarak globin moleküllerinin translasyon kinetiğine bakmaya karar verdiğimizde ortaya çıkmıştır.

Globin translasyonunun heterojenliği, 1974 yılında PRO ve Maurice tarafından globin NAS ve zincirlerinin boyut dışlama CLO kromatografisi kullanılarak ilk kez fark edilmiştir. Ancak, Pro ve Maurice'in analizleri istenen hassasiyete sahip değildi ve globin translasyonu sırasında dört ana translasyon duraklama bölgesi gözlemlenmiştir. Sonrasında, bizim analizimiz yaklaşık 10 ek duraklama bölgesinin ortaya çıkarılmasını sağlamış ve translasyonel globin katlanmasının ayrıntılı bir modelinin oluşturulmasına imkan tanımıştır. Burada açıklanan teknik, polizom izolasyonunu ve Tri S Ds page jeli kullanılarak yeni sentezlenen polipeptidlerin analizini içerdiğinden, bu yöntemin görsel demonstrasyonu kritik önem taşımaktadır.

Her iki adım da yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Progel uygulaması, Myelo laboratuvarından bir lisansüstü öğrencisi tarafından gerçekleştirilecektir. Messenger RNA'nın in vitro transkripsiyonu için, uygun bir restriksiyon enzimi kullanılarak T7 ve/veya SP6 promotörü altına klonlanmış hedef bir gen ile başlayın; DNA kalıbını stop kodonunun aşağısından ve/veya mRNA 3' ucundan lineerize edin.

DNA'nın tamamen lineerleştiğini doğrulamak için restriksiyon sindirim örneğine agaroz jel elektroforezi uygulanır. Optimum DNA kalıp konsantrasyonu belirlendikten sonra, üretici talimatlarına uygun olarak bir transkripsiyon kiti kullanarak haberci RNA'nın in vitro transkripsiyonu gerçekleştirilir. Ardından, mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çöktürmesi yöntemi kullanılır.

Ardından, saflığını doğrulamak için akrilamid veya agaroz jel elektroforezi kullanın. Nükleaz içermeyen su içinde; metiyonin hariç 1 mM amino asit karışımı, 10 ünite RNA inhibitörü, 20 µCi radyoaktif 35S metiyonin ve tavşan retikulosit lizatı ekleyerek 100 µL'lik bir in vitro translasyon reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra reaksiyonu 30 °C'de beş dakika inkübe ederek ön ısıtma yapın.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için iki µg mRNA ekleyin ve 30 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin, ardından ribozomlara bağlı yeni sentezlenen polipeptidleri izole etmek için örneği buz üzerine yerleştirin. Translasyon reaksiyonunu, potasyum klorür ve magnezyum klorür içeren 4,5 mL %30 gliserol Tris-HCl pH 7.6 üzerine katmanlayın ve TLA 110 rotor santrifüj kullanarak 4 °C'de bir saat boyunca 100.000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve yeni sentezlenen polipeptidleri içeren polisomal peleti, 0,5 mg/mL ribonükleaz A içeren küçük bir hacim 1 mM Tris-HCl pH 7.6 tamponunda yeniden süspande ederek 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Peptit TRNA ester bağının hidrolizini artırmak için, reaksiyona 10 milimolar son konsantrasyonda sodyum hidroksit ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Yeni sentezlenen polipeptitleri tris tri SDS page ile ayırın, ardından jelleri sabitleyip kurutun. Yeni sentezlenen polipeptitlerin tespiti için jellere önce otoradyografi, ardından fosfor imajlama uygulayın.

tRNA havuzundaki değişikliklerin tetiklediği değişmiş ribozom hareketi, translasyon sırasında biriken yeni sentezlenen polipeptitlerin boyut dağılımında ve buradaki duraklamanın süresini yansıtan bağıl yoğunluklarında değişikliklere yol açmalıdır. Gamma B kristalin proteini için yeni sentezlenen polipeptitler izole edilmiş ve Tristine SDS-PAGE ile ayrıştırılmıştır. RRL ve E. coli sistemlerindeki polipeptitlerin farklı uzunlukları ve yoğunlukları, bu iki sistemde ribozomların mRNA boyunca hareketinin farklı translasyon kinetikleri izlediğini göstermektedir.

Örneğin, rabbit reticulocyte lizat sisteminde bulunmayan, e coli lizatındaki belirgin 17.7 kilodalton bandına dikkat edin. Gamma B crystalline, memeli sistemlerinde yaygın olan ancak e coli'de son derece nadir olduğu ve yavaş çevrildiği bilinen tandem arginin kodonlarını barındırır; bu durum, buradaki bandın ribozomun bu tandem nadir kodonlarda duraklamasından kaynaklandığını göstermektedir.

mRNA yokluğunda herhangi bir bant gözlemlenemez ve purmycin işlemi polizomdan yeni sentezlenen zincirlerin çoğunu uzaklaştırır. Ayrıca, purmycin ile yapılan uzun süreli işlem, polizom ile birlikte çöken MRP'lerden ziyade, gözlemlenen polipeptit ürünlerinin ribozoma bağlı yeni sentezlenen zincirler olduğunu doğrulayarak tüm yeni sentezlenen zincirleri uzaklaştırır. Bu teknik ustalığında uzmanlaşıldığında, bir ila iki günde tamamlanabilir. Prosedürün süresi temel olarak santrifüjleme adımının ve yeni sentezlenen peptit jel elektroforezi adımının süresine bağlıdır.

Bu prosedürü uygularken, inkübasyon süresinden hemen sonra translasyon reaksiyonunu durdurmak önemlidir. Yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasını önlemek için, herhangi bir adımda RNA'ların bulunmaması kritik önem taşır. RNA kontaminasyonu, ekstraktın translasyon verimliliğini etkileyebilir ve bu prosedür takip edildiğinde yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasına yol açabilir.

Geliştirildikten sonra, örneğin mRNA bağlayan proteinlerin belirli bir mesaj üzerindeki ribozom hareketleliği üzerindeki etkileri gibi diğer hedefler de test edilebilir. Bu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların, translasyonel protein katlanmasında nadir kodların varlığı nedeniyle ortaya çıkan translasyon duraksamasının rolünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu teknik, daha önce bir mesaj üzerindeki ribozom hareketliliği ve translasyonel protein katlanması üzerinde kodon substitüsyonlarının rolünü test etmek için kullanılmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, ribozoma bağlı yeni sentezlenen polipeptitlerin izole edilerek, sunulan mRNA'daki translasyonel güç bölgelerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif izotoplar ve örneğin [35S]metiyonin gibi işaretli amino asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.