İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, insan pankreasını anatomik oryantasyonu koruyacak şekilde diseke etmektir. Bu işlem, duodenum ve dalağın pankreastan çıkarılması, ardından pankreastaki fazla yağ ve damarların temizlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise anterior yüzeyin mavi mürekkeple, posterior yüzeyin ise siyah mürekkeple boyanmasıdır.

Ardından, pankreas üç bölgeye ayrılır. Her bölge daha sonra enine eşit dilimler halinde kesilerek parafin kasetlerine, OCT kalıplarına yerleştirilir veya daha küçük parçalara ayrılıp viallere konur. Sonuç olarak, gelecekteki analizler için doğru anatomik yönelim korunarak pankreasın her üç bölgesinden örnekler toplanır.

Bu yöntem, beta hücre kütlesinin veya fonksiyonunun kaybının altında yatan mekanizmalar ya da immün hücre saldırısının doğası gibi tip 1 diyabet araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Pankreasın in vivo oryantasyonunun korunması ayrıntılara dikkat gerektirdiği için, pankreas işleme yönteminin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü, laboratuvarımdaki histoteknoloji uzmanı Linda Snyder ve biyolog Emily Montgomery gerçekleştirecektir.

İşleme başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri hazırlayın. İlk olarak, parafin blokları tutacak kasetleri donör kimliği, örnek tipi, alikvot numarası ve diğer ek bilgilerle etiketleyin. Ardından, OCT kalıplarını da aynı şekilde etiketleyin.

Her bir OCT bloğunu sarmaya yetecek kadar alüminyum folyo parçası kesin ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. Taze ve dondurulmuş örnekleri saklamak için gereken tüm tüpleri hazırlayın. Uygun olduğunda RNA later ve RPMI besiyeri ekleyin.

Ardından çalışma alanlarını hazırlayın; diseksiyon tahtalarını, sterilize edilmiş aletleri ve prosedür için gerekli olan diğer tüm malzemeleri hem bir biyogüvenlik kabinine hem de bir tezgah üzerine yerleştirin. Tüm kasetleri ve OCT kalıplarını kullanım sırasına göre yakın bir yere düzenleyin. Bir strafor kutunun tabanındaki kuru buzu örtecek kadar izopentan ekleyerek bir dondurma banyosu oluşturun.

Diseksiyona başlamak için duodenumu ve dalağı çıkarın. Bir uçtan duodenum ve pankreası ayırmaya başlayın ve tamamen ayrılana kadar devam edin. Dalak gevşek bir şekilde bağlıdır ve yağ ile pankreastan kolayca çıkarılabilir.

Ardından, pankreasi küt ve keskin diseksiyon kombinasyonunu kullanarak yabancı yağ, damar ve sinirlerden temizleyin. Daha sonra işlenecek olan yağ ve lenf nodlarını kenara ayırın. Temizleme işlemi tamamlandıktan sonra, pankreasi kağıt havluyla kaplanmış bir diseksiyon tahtasına yerleştirin.

Pankreasın doğru oryantasyonunun korunması, bu prosedürün en zor yönüdür. Başarıyı sağlamak için, ön ve arka yüzeyler farklı renklerdeki mürekkeplerle boyanır. Pamuk uçlu bir aplikatörü mavi mürekkebe batırın, mürekkebi pankreasın ön yüzeyine yayın ve fazlalığı tamponlayarak temizleyin.

Ardından, yeni bir aplikatörü siyah mürekkebe batırın ve pankreasın posterior yüzeyine sürün. Pankreası normal yönelimine geri getirin. Anterior yüzey yukarı bakacak şekilde, pankreas artık üç bölüme kesilmeye hazırdır.

Öncelikle, baş ile gövde arasındaki bağlantıyı kesin. Ardından, gövde ve kuyruğu ayırmak için geri kalan kısmı yaklaşık olarak eşit parçalara bölün ve pankreasın her bir bölgesinin ağırlığını kaydedin. Baş bölümüyle başlayın.

Her bir bölgeyi, bir ekmek dilimler gibi enine keserek yaklaşık 0,5 santimetrelik bölümlere ayırın. Pankreasın her bölgesi dilimlendikten sonra, baş bölgesinin son kısmı olan baş-gövde bileşke bölümünü çıkarın ve ayrı bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Bu bölümü küçük parçalar halinde doğrayın ve parçaları, RNA içeren ve içermeyen etiketli kriyoviyallere eşit şekilde paylaştırın.

Daha sonra vialler dondurulur. Standart prosedürler takip edilir. Bu işlemi gövde-kuyruk eklem bölümü için tekrarlayın.

Kıyılmış örnekler toplandıktan sonra, tüm transvers kesitleri sağa doğru eğikleştirin. Her bölgenin birbirini izleyen kesitleri sırayla kaldırılacaktır. Parafin ve OCT blokları için, parafin bloklama işlemi için ilk kesiti kaldırın.

Eğer bir bölüm çok büyükse, ikiye bölün. Kasetleri A ve B olarak etiketleyin. Parça hâlâ çok büyükse, her bölümü önceki kesime dik olacak şekilde kesin ve ardından kasetleri saat yönünde A'dan D'ye kadar etiketleyin. Burada görüldüğü gibi, etiketi sola gelecek şekilde kaseti konumlandırın.

Ardından, dokuyu kasede yerleştirin ve kapağı kapatın. Kasedi, nötr tamponlu formalin içeren bir kaba aktarın. OCT blokları için en medial kesitten başlayarak, her bölge içindeki blokları sırasıyla numaralandırın.

Önceden etiketlenmiş bir kalıba ince bir tabaka OCT medyası dökün. Dokuyu yerleştirmeden önce, dokuyu OCT medyası ile kaplayın ve daha önce kenara ayrılan dokuya geri dönerek örneği sonraki kullanım için hızla dondurun. Düğüm kapsülünü çevreleyen yağ ve bağ dokusunu budayarak pankreatik lenf düğümlerini izole edin. Düğümleri DMEF içeren steril bir kaba yerleştirin ve büyük düğümleri 0.5 santimetreden daha büyük olmayan parçalara ayırın.

Pankreas lenf düğümleri izole edildikten sonra, dokuyu ileri işlemler için hazırlanan tüpler ve kasetler arasında paylaştırın. Lenf düğümleri tamamlandıktan sonra, dalak kıyılır ve benzer şekilde saklanır. Duodenumu işlemek için, mukozayı mukusla temizlemek amacıyla nemli bir gazlı bez kullanın, mukozayı kesin ve ardından bölümlere ayırın.

Mukoza örneklerini daha önce gösterildiği gibi bölün. Bu prosedür kullanılarak, burada görüldüğü üzere pankreasın her bölgesinden temsili örnekler toplanır. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinin ağırlıkları yaklaşık olarak eşitti.

Bu videoyu izledikten sonra, insan pankreasının farklı örnek türlerine nasıl dönüştürüleceği, özellikle yönelimin nasıl korunacağı ve peripankreatik yağdan lenf düğümlerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.