Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyon için fare bağırsak dendritik hücrelerini (dc'ler) ve makrofajları hızla izole etmektir. Bu işlem, öncelikle bağırsak dokusunun hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bağırsak epitelyumunun lamina propriadan ayrıştırılmasıdır.

Ardından, prosedürün son adımlarında intestinal lamina propria sindirilir. Lamina propria hücreleri floresan konjuge antikorlarla boyanır ve spesifik hücre popülasyonları için kapılanır. Sonuç olarak, intestinal DC ve makrofaj popülasyonları daha doğru bir şekilde karakterize edilebilir ve sitokin üretimi, antijen sunumu ve bağışıklık hücrelerinin regülasyonunu değerlendirmek üzere fonksiyonel çalışmalar için saflaştırılabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doku sindiriminin hızlı gerçekleşmesinin optimal hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu, hücre canlılığını ve hücre bütünlüğünü sağlamasıdır. Fareyi ötanize edip ölümünü ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile onayladıktan sonra, hayvanın abdomen ve toraks bölgesine %70 ethanol püskürtün. Ardından, bir makas kullanarak abdomenin ortasında küçük bir yatay insizyon yapın ve peritonyumu açığa çıkarmak için deriyi geriye doğru soyun.

Mideyi üst ince bağırsaktan ayırmak için pilor sfinkterinden kestikten ve mezenteri ayırmak için pens kullanıp uzaklaştırdıktan sonra, peritonyumu makasla açın. Tüm ince bağırsağı kalın bağırsaktan serbest bırakmak için ileoçekal valvden tekrar kesin. Mezenteri kalın bağırsaktan ayırmaya devam edin ve anal verge bölgesinden bir kesi yapın.

Kolonu boyuna kesmek için makas kullanın ve bağırsak lümenindeki fekal içeriği ve mukusu temizlemek için oda sıcaklığındaki C-M-F-P-B-S'yi kullanın. Ardından, ince bağırsağın anti-mezentrik yüzeyi boyunca yer alan Peyer plaklarını makroskobik olarak diseke etmek için makas ve pens kullanın ve ince bağırsağı boyuna kesin.

Ardından, ince bağırsak lümenindeki dışkı içeriklerini ve mukusu oda sıcaklığındaki C-M-F-P-B-S ile temizleyin. Ayrı olarak, ince ve kalın bağırsakları yaklaşık 1,5 santimetre boyutunda parçalara kesin ve bu parçaları, içerisinde FBS ve iki millimolar EDTA içeren 30 mililitre ön ısıtmalı C-M-F-H-B-S-S bulunan ayrı 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Her bir 50 mililitrelik konik tüpü bir orbital çalkalayıcıya yatay olarak yerleştirerek tüpleri 37 degrees Celsius sıcaklıkta 20 dakika boyunca 250 RPM hızında çalkalayın.

Ardından, bir atık kovasının üzerine tek bir tel süzgeç yerleştirin. Bağırsak parçalarını geri kazanmak için her bir 50 mililitrelik konik tüpün içeriğini süzgeçten geçirin ve ardından bunları, içinde 2 mmol EDTA ile FBS içeren ön ısıtılmış 30 mililitre C-M-F-H-B-S-S bulunan yeni ve ayrı 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Son olarak, tüpleri 20 dakika daha orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

İkinci çalkalama aşamasından sonra, her tüpün içeriğini süzgeçten dökün. Tekrar bir kağıt havlu kullanarak fazla medyayı tamponlayın ve ardından bağırsak parçalarını küçük plastik bir whey teknesine aktarın. Bu tekniğin en zor kısmı doku sindirimidir; başarıyı sağlamak için sindirme süresinin tüm farklı parametreleri, kollajenazın özellikleri, doku bütünlüğü ve sindirilecek dokunun boyutu, makas kullanılarak hızlıca gerçekleştirilmek üzere dikkate alınmalıdır.

Bağırsak parçalarını doğrayın ve ardından kıyılmış bağırsağı 20 milliliters kollagenaz çözeltisi içeren 50 millimeter konik tüpe ekleyin. Konik tüpü orbital sarsıcıya yatay olarak yerleştirin ve bağırsak parçalarını 37 degrees Celsius sıcaklıkta, 200 RPM hızında 10 ila 20 dakika boyunca sindirin. Şimdi, kalan bağırsak dokularının tamamen ayrıştığından emin olmak için tüpü kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından hücre süspansiyonunu 100 micron hücre süzgeci aracılığıyla doğrudan 50 milliliter konik bir tüpe filtreleyin.

Son olarak, konik tübü FBS içeren C-M-F-H-B-S-S ile tamamlayın ve hücre solüsyonunu 4 °C'de 425 ×g'de beş dakika boyunca iki kez santrifüjleyin. Ardından süpernatanı dökün ve hücre peletini buz gibi soğuk, FBS içeren C-M-F-H-B-S-S içinde yeniden süspande ederek örnekleri buza yerleştirin. Hücreleri ilgilenilen yüzey proteinleri için boyadıktan sonra.

Burada gösterildiği gibi, ölü hücre boyası için pozitif olan hücreleri hariç tutarak bir nokta grafiği (dot plot) oluşturarak başlayın. Ardından, burada ve şurada gösterildiği gibi dublet olayları hariç tutun. Şimdi, kalıntıları hariç tuttuğunuzdan emin olarak, ilgilenilen hücreleri belirlemek için ileri ve yan saçılım (forward and side scatter) kanallarını kullanarak kapılama (gate) yapın.

Ardından, CD 45 pozitif ve IAB pozitif antijen sunan hücreleri kapılayan başka bir nokta grafiği (dot plot) oluşturun. Spesifik DC ve makrofaj alt kümelerini ayırt etmek için ayrı bir nokta grafiğinde bölgeler oluşturun. Burada gösterilen R1 bölgesi, CD 11 C pozitif CD 11 B düşük/negatif hücreleri kapsar.

R iki bölgesi, CD 11 C yüzey ekspresyon seviyesi R bir bölgesindeki hücrelere benzer olan ancak aynı zamanda CD 11 B eksprese eden hücreleri tanımlar. R üç bölgeleri, CD 11 B pozitif ve CD 11 C düşük negatif olan hücreleri belirtir. Bu üç bölge, sırasıyla makrofaj ve DC popülasyonlarını ayırt etmek için F dört 80 ve CD 1 0 3 ekspresyonu açısından daha detaylı analiz edilebilir. Bu nokta grafiğinde görüldüğü üzere, R bir bölgesindeki CD 11 C pozitif CD 11 B düşük negatif hücreler, yüksek düzeylerde alfa ein CD 1 0 3 ve düşük düzeylerde F dört 80 eksprese edecektir.

Bu nokta grafiği, R2 bölgesindeki CD11B pozitif CD11C pozitif hücrelerin, CD103 ve F4/80'in dikotomik ekspresyonlarına dayanarak hem DC'lerden hem de makrofajlardan oluşacağını göstermektedir. Son olarak, F4/80 pozitif ve CD103 negatif fenotipik profillerine dayanarak, R3'te kapılan CD11B pozitif CD11C delta negatif hücreler makrofajlardan oluşacaktır; doku sindirim süresinin toplam hücre verimi ile CD11B ve CD11C ekspresyonu arasındaki ilişki sonraki altı şekilde gösterilmiştir. Üç dakika boyunca sindirilen bağırsak dokusu düşük bir toplam hücre sayısı verir, bu da karakterizasyon için mevcut az sayıda DC ve makrofaj ile sonuçlanır; 11 dakikalık doku sindirimi, yüksek düzeylerde CD11B ve CD11C eksprese eden, fenotipik olarak belirgin DC ve makrofaj popülasyonları sağlayarak canlı hücrelerin güçlü bir verimini üretir.

Buna karşılık, 50 dakikalık sindirim, optimize edilmiş sindirim ile benzer bir hücre verimi sağlar. Ancak, CD 11 B ve CD 11 C kullanılarak farklı hücre popülasyonlarının belirlenmesi daha zor hale gelir. Çünkü CD 11 C ekspresyonu azalmakta ve ölü hücre sayısı artmaktadır.

Böylece, bağırsak dokusu sindirimi için parametreler optimize edildiğinde, hızlı bir şekilde yüksek hücre verimi elde edilebilir. Sonuç olarak, fare bağırsak dendritik hücrelerinin ve makrofajlarının hızlı izolasyonu, yüzey antijenleri bozulmamış immün hücrelerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için faydalı olabilir.