İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu videoda, modifiye edilmiş HEK 293 T hücrelerinden salgılanan proteinlerin ekspresyonu için zaman ve maliyet açısından verimli bir prosedürü tanımlıyoruz. Başlangıçta, altı kuyucuklu bir plakada %40 konfluensli bir HEK 293 T hücre kültürü hazırlanır. Ardından, önce gene juice, ardından test plazmidleri serumsuz medyada seyreltilerek bir transfeksiyon karışımı hazırlanır.

Transfeksiyon karışımı hücrelerin üzerine eklenir ve protein ekspresyonunun gerçekleşmesi için hücreler 37 °C'de inkübe edilir. Süpernatanttaki proteinin tespiti western blot ile gerçekleştirilebilir. Uygun bir konstrükt belirlendikten sonra, prosedür 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanılarak ölçeklendirilebilir.

Hücreler, transfeksiyon ajanı olarak PEI kullanılarak transfekte edilir. Protein, kültür süpernatanlarından önce tanjansiyel akış filtrasyonu ve ardından afinite kromatografisi kullanılarak hasat edilebilir. Nihayetinde bu platform, geniş bir makromolekül yelpazesinin miligram miktarlarda ekspresyonuna olanak tanır.

Bu tekniğin, baculovirüs tabanlı böcek hücresi ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda konstrüktün taranabilmesi ve ekspresyon için ölçeklendirilebilmesi ve sonuçların üç hafta gibi kısa bir sürede elde edilebilmesidir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan üç lisansüstü öğrenci olan Hello Aiden, Shada Zini ve Jonathan Cook uygulamalı olarak gösterecekler. Altı kuyucuklu bir plakada, kuyucuk başına 1 mL hacimde 250.000 HEC 2 9 3 T hücresi ekerek başlayın; kuyucuk başına 1 mL %10 FBS ve penisilin-streptomisin ilave edilmiş DMEM ekleyin ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için plakayı hafifçe sallayın.

Ardından hücreleri, nemlendirilmiş %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücreler yaklaşık %40 konfluense ulaştığında, transfeksiyon karışımını hazırlamak için süpernatantı iki mililitre taze besiyeri ile değiştirin. İlk olarak, bir eppendorf tüpüne 90 µL serumsuz DMEM alikotlayın.

Ardından, transfeksiyon reaktifi olan üç µL gene juice ekleyin, tüpün içeriğini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Sonrasında, transfekte edilecek mini prep ile saflaştırılmış plazmid DNA'nın 100 ng/µL konsantrasyonundaki stok çözeltisinden 10 µL ekleyin.

Tüpteki içeriği karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Transfeksiyonu gerçekleştirmek için karışımı HEC 2 9 3 T hücrelerinin üzerine ekleyin. Transfeksiyon karışımının eşit şekilde dağılması için plağı nazikçe sallayarak damla damla ekleme yapın.

Ardından hücreleri 37 °C'de inkübe edin. 24 saat sonra, her kuyucuğa 1 mL taze besiyeri ekleyin ve 48 saat daha inkübe edin. Transfeksiyondan üç gün sonra, süpernatantı toplayın ve hedef proteinin ekspresyon seviyelerini western blot ile belirleyin.

Uygun bir konstrükt belirlendikten sonra, transfeksiyon prosedürü ölçeklendirilebilir. 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanarak, bir hücre fabrikasını %5 FBS ile desteklenmiş 1,2 litre DMEM ile doldurun. Ardından, hücreleri tüm katmanlara eşit şekilde dağıtarak 200 milyon HEC 2 9 3 T hücresi ekleyin.

%100 konfluense ulaşmış dört adet T 225 santimetrekare hücre kültürü flaskı yaklaşık 200 milyon hücre içerir. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 840 µg DNA'yı 84 mL steril 1x PBS içinde seyrelterek bir T 75 flaskında transfeksiyona karışımını hazırlayın.

1 mg/mL konsantrasyonunda 2,5 mL polietilenimin çözeltisi veya PEI ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çözelti bulanıklaşmalıdır. Ardından, transfeksiyon karışımını hücre fabrikasına yavaşça boşaltın ve iyice dağıtın.

Genel katmanlar. Son konsantrasyonu 4 mM olacak şekilde valproik asit ekleyin. Bu işlem, transfeksiyon karışımı eklendikten sonra ekspresyon verimlerini artıracaktır.

Protein ekspresyonuna izin vermek için kültürü 37 °C'de dört gün boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan dört gün sonra besiyerini hasat edin ve hücre fabrikasını yeniden kullanım için hemen temizleyin; toplanan besiyerini 4 °C'de 30 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüjleyin ve partikül maddeleri uzaklaştırmak için 0,22 µm'lik steril kup vakum filtre düzeneği üzerinden süzün. Ardından, süpernatantı 75 mL'ye konsantre etmek için CentraMate tanjansiyel akış filtrasyon sistemini kullanın.

Süpernatan konsantre edildikten sonra, hedeflenen protein afinite kromatografisi ile saflaştırılabilir. Bu deneyde, insan AAL iki reseptörlerinin hücre dışı alanının HA eklenmiş alt birimlerini, burada açıklanan büyük ölçekli sistem ve ardından yüksek afiniteli anti-HA kromatografisi kullanarak saflaştırdık. Bu durum, Coomassie ile boyanmış SDS-PAGE analizinde gösterilmiştir.

İnterlökin iki reseptör alfa ve gama alt birimlerinin hücre dışı domenleri 40 kilodalton ve 46 kilodalton moleküler ağırlıklarda göç eder. IL iki R alfa ve IL iki R gama üzerinde bulunan EnLink glikanlarının heterojenliği, SDS page jelinde bant genişlemesine neden olmuştur. Daha yüksek moleküler ağırlıktaki bant, kontamine BSA'yı temsil etmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanarak insan hücre kültüründen proteinlerin nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. HC 2 93 T hücrelerinin biyotehlikeli kabul edildiğini ve biyogüvenlik düzeyi iki'de işlenmesi gerektiğini unutmayın. Lütfen her zaman uygun kişisel koruyucu kıyafetler giyin ve yüzeyler kurumsal ve hükümet yönergelerine uygun olarak dezenfekte edilmelidir.