Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, hücre döngüsünün kinetiğini ve ilerlemesini ölçmektir. İlk olarak hücreler, timidin yerine hücre DNA'sına dahil olan romo, deoxy, üridin veya BRDU ile pulse-chase yöntemiyle işaretlenir. Ardından hücreler, BRDU'ya karşı antikorlar ile immün boyanır ve boyama işleminden hemen sonra akış sitometrisi ile analiz edilir.

İşaretli hücreler hücre döngüsü boyunca G2 evresine ilerledikçe, yalnızca S fazındaki hücreler işaretlenir. Bu hücreler, mitoz sonrası 4N DNA içeriğine sahip oldukları şeklinde tespit edilir. DNA içeriği 2N'ye düşer. Bu nedenle, akış sitometrisi ile oluşturulan floresan profillerinin analizi, hücre döngüsü ilerlemesinin kinetiğini belirlemek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, hücre senkronizasyonu için kimyasallar kullanan diğer protokollerle kıyaslandaki temel avantajı, hücre bölünme mekanizmasını istenmeden etkileyebilecek fizyolojik pertürbasyonların olmamasıdır. Bu yöntemi ilk kez, kimyasal senkronizasyon kullanarak hücre döngüsü ilerleme hızını inceleme girişimlerimizin, analizlerimizi engelleyen beklenmedik sonuçlar vermesi üzerine kullandık. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, farklı hücre tipleri arasındaki farklı büyüme hızlarının temeli nedir? Bunu yapmak için bu protokole hücreleri BRDU ile pulse-chase etiketleyerek başlayın. Her bir zaman noktası için bir adet 10 santimetrelik plaka ve ayrıca aşağıdaki kontrollerin her biri için birer plaka etiketleyerek başlayın.

Yalnızca BRDU, yalnızca PI, BRDU negatif PI negatif; her plak 5x10⁵ MCF 7 hücresi ile desteklenmiş DMEM içerisinde ekilir. Hücrelerin toparlanması ve tutunması için plaklar 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilir. Hücreler %60 konfluense ulaştığında, besiyeri 10 µM içeren taze DMEM ile değiştirilir.

BRDU'nun DNA'ya dahil olmasını sağlamak için hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ortamında bir saat boyunca inkübe edin. Bir plakayı, bir saat sonra negatif kontrol veya sıfır zaman noktası olarak hizmet etmesi için işlem görmemiş olarak bıraktığınızdan emin olun. Puls etiketleme ortamını uzaklaştırın ve iki ila sekiz saatlik zaman noktalarına kadar hücreleri kısaca PBS ile durulayın.

Taze büyüme ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, bir sonraki bölümde açıklandığı şekilde sıfır ve bir saatlik zaman noktası plakalarını hemen hasat edin. Hücreleri hasat etmek için ortamı aspire edin ve plağı durulayın.

Önce PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri plakadan ayırmak için tripsin uygulayın ve hücreleri DMEM içinde toplayıp 390 ×g'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın. Ardından hücreleri 1-5 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayıp 390 ×g'de beş dakika santrifüj edin; santrifüj işleminin ardından süpernatantı atın ve hücreleri 100 µL buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.

%1 FBS içeren soğuk PBS. FBS, hücre kümelenmesini önlemeye yardımcı olur. Bu prosedürün en önemli yönlerinden biri, hasat edilen hücrelerden tek hücre süspansiyonu elde ettiğinizden emin olmaktır.

Gerçekler için. Bunu başarmak için, hücrelerinizi etanol damlasına damla damla ekleyebilirsiniz. Bu kritiktir. Hücreleri sabitlemek için, hücreleri beş mililitre buzlu koda damla damla eklemek üzere pipeti kullanın.

15 mililitrelik konik tüp içerisinde %70 etanol. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin veya gece boyunca dört derece Celsius'ta saklayın. Bu adım, çeşitli zaman noktalarından örnek toplama işlemini durdurmak için idealdir; örnekler birkaç gün boyunca etanolde bırakılabilir, böylece BRDU ve propidyum iyodür boyamalarını gerçekleştirmek için protokolün geri kalan kısmında eş zamanlı olarak işlenebilirler.

Hücreleri dört °C'den çıkarın ve 90 ×g hızında beş dakika boyunca üç kez santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, yaklaşık 50 µL kalacak şekilde fiksatifin çoğunu aspire edin. Ardından vorteksleyin.

Vorteksleme sırasında DNA'yı denatüre etmek için peleti gevşetin. Bir mililitre 2N HCl Triton X 100'ü damla damla ekleyin ve ardından örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Örnekleri 390 ×g'de beş dakika santrifüj ederek hücreleri peletleyin, ardından süpernatantı aspire ederek atın.

Ardından hücre peletini bir mililitre 0.1 molar sodyum tetraborat içerisinde yeniden süspande edin. Santrifüj işleminden sonra hücreleri tekrar aspire edin ve süpernatanı atın. Daha sonra hücre peletini 75 mikrolitre BRDU boyamasında yeniden süspande edin.

Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri daha önce yapıldığı gibile santrifüjle çöktürün ve hücre peletini, mililitre başına beş mikrogram propidyum iyodür içeren bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. PI pozitif örneği akış sitometresinden geçirirken, hücrelerin doğru boyut dağılımını sağlamak için ileri saçılma ile yan saçılma karşılaştırmalı bir grafik oluşturun.

Bu iki parametre de doğrusal bir ölçekte çizdirilmelidir. PI boyanmasını floresan pals genişliğine göre görüntülemek için aynı anda FL three H'e karşı FL two W grafiğini görüntüleyin. Bu grafik, hücre döngüsünün normal dağılım örüntüsü içinde olduğu düşünülen hücre fraksiyonunu izole etmek için bir kapı (gate) oluşturmak amacıyla kullanılır.

Genel olarak, bu dağılım paterni, hücre döngüsünün sırasıyla G1 ve G2 fazlarını temsil eden, PI boyamasının 2N ve 4N DNA içeriğine sahip iki hücre kümesi ile karakterizedir. Bu iki küme arasında yer alan hücre dizisi, hücre döngüsünün S fazında gerçekleşen devam eden DNA replikasyonunu temsil eder. Y ekseninde logaritmik ölçekte FL1-H veya FITC, X ekseninde ise lineer ölçekte PI ile kapılamış (gated) hücreleri gösteren bir grafik oluşturun.

Bu grafik, çeşitli kontroller kullanılarak kalan parametrelerin ayarlanmasının yanı sıra veri toplamak için de kullanılacaktır. Analiz için, sadece PI boyalı örneği akım sitometresinin yükleme portuna yerleştirin ve G1'i x ekseninde yaklaşık 200'e konumlandırmak için kazancı (gain) ayarlayın. Bunu, PI boyamasının bir histogram grafiğinde görselleştirmek daha kolay olacaktır.

Ardından, yalnızca BRDU içeren örneği yükleme portuna yerleştirin ve çalıştırın. BRDU pozitif ve BRDU negatif olmak üzere iki hücre popülasyonu grafikte görünecek şekilde kazancı (gain) ayarlayın. İdeal olarak, BRDU negatif hücreler 10¹ değerinin hemen üzerinde veya altında konumlanmalıdır.

Son kontrol, BDU/PI negatif örneğidir. Hücrelerin üst veya sağ kadranların hiçbirinde görünmediğinden emin olmak için bu negatif kontrolü çalıştırın. Çeşitli grafiklerin parametreleri ayarlandığında, akış sitometresi kalibre edilmiş olur ve BrDU ile PI boyanmış hücrelerin işlenmesine hazır hale gelir. Her örnek için PI kapılı hücrelerden minimum 10.000 hücre olacak şekilde veri toplayın.

Ardından, FlowJo veya fax diva gibi bir yazılım kullanarak, PI versus FL iki W grafiğinden PI pozitif olarak seçilen (gate edilen) hücrelerle, FITC'ye karşı PI grafiği oluşturun. Bu işlem, döngüdeki popülasyonu ayırt etmek içindir. Daha sonra, BRDU pozitif popülasyonu izole etmek için ikinci bir kapı (gate) oluşturun.

Ardından, hücre döngüsü ilerlemesinin zaman seyrini takip etmek için, hücre döngüsü ilerleme kinetiğini iki kolorektal hücre hattı olan HT 29 ve LS 180 arasında karşılaştırmak amacıyla, G1 veya G2 içeriğine sahip BRDU pozitif hücre sayısını zamanın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. Hücreler, A-B-R-D-U pulsunun kaldırılmasını takiben sekiz saat boyunca her saat başı toplanmıştır.

İki profilin kinetikleri karşılaştırıldığında, LS 180 hücrelerinde BRDU sonrası t eşittir dört saatte bir G1 piki belirdiği açıkça görülürken, HT 29 hücre hattının karşılık gelen zaman noktasında bu pikten yoksun olduğu görülmektedir. Bu durum, hücre döngüsünün G2 fazı boyunca hızlandırılmış bir hücre döngüsü ilerlemesine işaret etmektedir. Meme kanseri hücre hattının döngü profilini oluşturmak için kolorektal hücre hattı LS 180'de.

BRDU darbesinin kaldırılmasının ardından, MC yedi hücreleri sekiz saat boyunca her saatte bir toplandı. İmmün etiketlenmiş ve DNA karşı boyaması yapılmış hücreler daha sonra floresan sinyallerine göre ayrıştırıldı.

Burada görülebileceği üzere, CF seven hücreleri, test edilen iki kolorektal hücre hattının her birinden önemli ölçüde daha yavaş bir hızda döngüye girmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA'nın metabolik etiketlemesinin zaman noktası hasadı ile birlikte kullanılarak hücre döngüsü kinetiğinin nasıl takip edilebileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.