Kanser BİYOMARKÖRLERİN Yerelleştirme Küçük Hayvanlarda Bilgisayarlı Tomografi eşliğinde Zaman alanı Diffüz Floresans Tomografi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ortotopik bir gliom fare modelinde epidermal büyüme faktörü reseptörü ekspresyonunun floresan görüntülerini üretmektir. Bu, bir A IIC faresinin sol serebral hemisferine, yeşil floresan protein eksprese eden insan U2 51 gliom hücrelerinin inoküle edilmesiyle gerçekleştirilir. Tümör iki hafta boyunca büyüdükten sonra, fareye iki floresan izleyiciden oluşan bir kokteyl enjekte edilir.

Ardından, doğru görüntü rekonstrüksiyonu için gerekli olan anatomik verileri toplamak amacıyla fare, küçük hayvan x-ışını sisteminde görüntülenir. Bu veriler, optik tomografi sisteminin kaynağını ve dedektör konumlarını anatomik olarak belirlemek için kullanılır; floresans verilerini toplamak ve nihai görüntüyü oluşturmak için ise özelleştirilmiş bir yazılım kullanılır. Sonuç olarak bu yöntem, hem floresans hem de x-ışını görüntülemesini kullanarak, epidermal büyüme faktörünün aşırı ekspresyonuna dayalı bir tümör görüntüsü oluşturabilir ve bu yöntemin doğruluğu, kontrastla güçlendirilmiş manyetik rezonans görüntüleme ile karşılaştırılabilir.

Bu tekniğin, şarj bağlı cihaz tabanlı küçük hayvan floresans tomografisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fotomültipliyer tüpler kullanılarak yapılan tek foton sayımlı deteksiyonun, ışık algılama için çok daha yüksek bir hassasiyet ve dinamik aralık sunmasıdır. Bu yöntem, nihayetinde hedef moleküllerin ekspresyonunu ölçerek moleküler tedavilerin başarısını izlemek ve değerlendirmek için kullanılabilir. Subkutan tümörler, yüzey görüntüleme kullanan non-tomografik yöntemlerle kolayca görüntülenirken; bu sistem, birkaç santimetre kalınlığa kadar olan dokuların içerisinden görüntüleme yapmak üzere tasarlanmıştır ve bu özelliğiyle özellikle beyin tümörlerine kontrast madde iletiminin ve sızıntısının görüntülenmesi için oldukça uygundur.

Bu yöntem kanser biyobelirteç ekspresyonu hakkında bilgi sağlayabilse de; enfeksiyon, obezite gibi diğer hastalık çalışmalarına veya Alzheimer gibi yaşlanma unsurlarına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, biyolojik dokulardaki ışık yayılımının difüz doğası ve difüz ışık rekonstrüksiyonu için x-ışını tomografisi kullanmanın zorluğu nedeniyle zorlanacaklardır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Veri toplama ve görüntü oluşturma adımlarının öğrenilmesi zor olabildiğinden, floresan sistemden toplanan verilerin iyi kalibre edildiğinden emin olmak önemlidir. Near fast yazılım paketi, optik verileri okumak ve floresans rekonstrüksiyonu için uzamsal bir şablon olarak kullanılan sonlu elemanlar ağını oluşturmak amacıyla X-ışını tomografi görüntülerini kullanmak üzere tasarlanmıştır. Başlamak için, anestezi uygulanmış atimik nude fareyi steril bir cerrahi örtü üzerine yerleştirin ve işleme devam etmeden önce anestezinin derinliğini doğrulayın; ardından insizyon bölgesinin üzerindeki cildi temizleyin ve dezenfekte edin.

Betadine kullanarak insizyon bölgesinin üzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirin; bir skalpel yardımıyla, orta hattın hafifçe solunda ve intraoküler hattın 0,5 santimetre posteriorunda küçük bir insizyon yapın. Referans noktalarının belirlenebilmesi için bağ dokularını temizleyerek kafatası yüzeyini temizleyin. Kafatası açığa çıktıktan sonra, merkez hattının iki milimetre solunda ve bgma'nın iki milimetre gerisinde bir delik açmak için steril bir milimetrelik uçla yüksek hızlı bir matkap kullanın.

Küt uçlu 27 gauge iğneye sahip bir Hamilton Micros şırıngayı implante edilecek hücrelerle doldurun. Ardından, fareyi bir stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Sonrasında, ayak parmağı sıkıştırma testi ile derin cerrahi ve estetik düzlemi doğrulayın ve cerrahi örtüyü hayvanın üzerine yeniden yerleştirin.

Ardından, doldurulmuş şırıngayı stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Şırıngayı kafatasındaki deliğin üzerine konumlandırın ve iğne ucunu kafatası yüzeyinin 3 mm altına yerleştirin. Son olarak, bir cep oluşturmak için iğneyi 1 mm geri çekin.

Bir sonraki adım, hücreleri beş dakikalık bir süre boyunca sol serebral hemisfer içine yavaşça enjekte etmektir. Enjeksiyon tamamlandığında, iğneyi geri çekin ve deliği Betadine ile silin. Hücrelerin enjeksiyon bölgesinin dışında büyümesini önlemek için fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve açık olan deliği önceden ısıtılmış kemik mumu ile doldurun.

Son olarak, insizyon bölgesini steril 5-0 naylon sütür ile kapatın. Fareyi ısıtılmış bir kafese geri yerleştirin ve iyileşene kadar izleyin; iyileşmenin ardından fareye IP yoluyla 130 µL 0,1 mg/kg buprenorfin enjekte edin ve görüntülemeden önce tümörün 14 gün boyunca büyümesine izin verin. Fare görüntüleme gününde, lazerlerin ve ışık dedektörlerinin yaklaşık 20 dakika boyunca ısınmasını sağlamak için sistemi başlatın.

Sürüklenmeleri ve sistem hassasiyetini önlemek için, uyarım lazerlerini sistemin deteksiyon kanalları arasında eşit yoğunlukta dağıtmak amacıyla, görüntüleme gantrisinin tam merkezine 100 derece çarpı dört derecelik mühendislik ürünü bir çizgi difüzörü yerleştirin. Beş ışık toplama kanalının tamamı tarafından algılanan sinyal miktarını maksimize etmek için difüzörün açısını elle ayarlayın. Ardından optik yoğunluk yerleştirin.

Tüm floresans deteksiyon fotomultiplier tüplerinin (PMT'ler) ve optik yoğunluğun önüne iki nötr yoğunluk filtresi yerleştirilir. Tüm geçirgenlik deteksiyonunun önüne ise bir nötr yoğunluk filtresi yerleştirilir. PMT'ler, her lazer için sırayla, her biri bir saniyelik entegrasyon süresine sahip 100 zamansal pals yayılım fonksiyonu veya T psf toplar; her TPSF'yi lazer referansına göre normalize eder, lazer referansındaki zamansal kaymayı düzeltir ve her detektör ile her lazer için iterasyonların ortalamasını ayrı ayrı alır.

Bu ortalama TPS'ler, görüntüleme işleminden 12 saat önce optik görüntü rekonstrüksiyonunda kullanılan dedektöre özgü cihaz yanıt fonksiyonlarıdır. Test faresine floresan izleyicilerden oluşan bir kokteyl enjekte edin. Floresan tomografi sisteminin doğru kalibrasyonu ve hayvan hareketinin kısıtlanması, bu prosedürün en zor yönleridir.

Görüntü rekonstrüksiyonu öylesine hatalı tanımlanmıştır (ill-posed) ki, veri toplamadaki küçük hatalar bile rekonstrükte edilen görüntüde önemli hatalara yol açabilir. Doğru verilerin toplandığından emin olmak için, fareyi mümkün olduğunca sabitleyecek şekilde immobilize ediyoruz ve doğru bir kalibrasyon elde etme şansını artırmak için tarama öncesinde ve sonrasında kalibrasyonu tekrarlıyoruz. Hazır olduğunda, anestezi altındaki hayvanı görüntüleme yatağının fiberglas desteklerine yerleştirin.

Sürekli gaz anestezisi için baş burun konisinin içine yerleştirildikten sonra, dişleri ısırma çubuğuna sabitleyin ve hayvanı bantla tutturun. Fare, görüntüleme gantrisinin yaklaşık merkezine yerleştirilmelidir. Bu konumlandırma, uyarım lazerinin fare etrafında 180 derece döndürülmesiyle gerçekleştirilebilir; böylece lazerin odak noktasının, tüm açılardan bakıldığında farenin yaklaşık merkezindeki bir noktayı aydınlattığından emin olunur.

Uygun şekilde konumlandırıldıktan sonra, görüntüleme tablasını ve fareyi dikkatlice mikro CT tarayıcıya aktarın ve farenin tüm kafası için 93 mikrometre izotropik çözünürlükte anatomik bilgiler toplayın. CT görüntü yığınını görselleştirin ve floresan tomografi sistemi ile görüntülenecek kesitleri seçin. Görüntüleme tablasını ve fareyi dikkatlice floresan tomografi sistemine geri aktarın.

Her bir görüntüleme dilimi için kaynak konum sayısını, her bir TPSF ölçümü için entegrasyon süresini, her bir kaynak konumu için iterasyon sayısını ve daha önce oluşturulan BT görüntü yığınından istenen görüntüleme dilimlerinin konumunu ve sayısını seçin. Ardından, tüm eksitasyon ışığını engellemek için floresans deteksiyon PMT'lerinin önüne filtreler, transmisyon deteksiyon PMT'lerinin önüne ise optik yoğunluk nötr yoğunluk filtreleri yerleştirin. Bu detektörlerin doygunluğa ulaşmasını önlemek için, her iki eksitasyon dalga boyunda, tanımlanmış her bir kaynak detektör konumunda floresans ve transmisyon t psf'lerini toplayarak veri toplama yazılımını çalıştırın.

Toplanan her T psf seti için, bir referans PMT kanalı ile lazer yoğunluğunu izleyin ve kaydedin. Farening dış yüzeyini ve görüntüleme yatağının konumunu belirleyin. CT görüntülerinden destek çubuklarını destekleyin ve farenin sınırlarını ve görüntüleme çubuğunu kapsayan maskeler oluşturun.

Ayrıca, near fast yazılımını kullanarak fare maskesinden hayvanın sonlu elemanlar ağını oluşturun. Mikro BT ve floresan uzaysal kayıt koordinatlarına dayanarak, floresans tomografi sistemindeki kaynak ve detektör konumlarını ağ yüzeyinde belirleyin. Görüntüleme tablasının konumuyla etkileşime giren kaynak veya detektör konumlarıyla ilişkili optik veri noktalarını kaldırın.

Destek çubukları, her bir kaynak detektör konumunda toplanan verileri lazer referansıyla normalize eder, lazer referansındaki zamansal kaymaları düzeltir ve satın alma sırasındaki deneysel testlerle belirlenen filtre hassasiyetlerini düzeltir. Her bir kaynak detektör konumu için verilerin Born oranını alın ve bunu, tekdüze optik özellikler için sonlu eleman hayvan ağına dayalı bir geçirgenlik ileri model simülasyonu ile çarpın. Bu işlem, kaynak veya detektörün dokuyla eşleşmesiyle ilgili hataları azaltmak, verileri modele göre kalibre etmek ve model veri uyumsuzluğunun diğer yönleri için verileri ayarlamak amacıyla yapılır; her iki dalga boyunda toplanan Born oranı verilerinin ölçeklendirilmiş farkından oluşan bir veri vektörü oluşturun.

Ölçeklendirme faktörü, EGFR bağlanma kontrastını maksimize etmek için seçilir; her bir deteksiyon kanalı için TPSF girdisi kullanılarak kalibre edilmiş fark verileriyle zaman alanı görüntü rekonstrüksiyonu gerçekleştirilir ve kontrastı artırılmış hedeflenmiş izleyicinin görüldüğü floresans haritaları oluşturulur. Burada, U2 51 ortotopik gliom tümörü olan bir fareden alınan, korejistre bir BT anatomik görüntüsü ile üst üste bindirilmiş bir floresans rekonstrüksiyonu örneği verilmiştir. Floresans rekonstrüksiyonu ile belirlenen gliom kütle merkezi, kontrast artırımlı manyetik rezonans görüntüleme ile belirlenen tümör kütle merkezinin bir milimetre yakınındaydı.

Veri toplama yazılımı bu cihaz için özel olarak geliştirilmiştir, ancak görüntü işleme tekniklerinin çoğu nearfasts.org adresinde mevcut olan near fasts yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, bu prosedür uygulanırken, görüntü rekonstrüksiyonu öncesinde hem sistemin hem de verilerin doğru şekilde kalibre edildiğinden emin olmak önemlidir. Bu kalibrasyon, biyobelirteç hedefli bir izleyicinin görüntü rekonstrüksiyonunu takiben, dedektörler arasındaki hassasiyet ve zamansal farkların hesaba katılmasını gerektirir.

Hedeflenmemiş bir izleyicinin benzer şekilde görüntülenmesi, reseptör aracılı olmayan tutulumun düzeltilmesi için bir araç sağlar. Bu, geliştirilmesinin ardından hem izleyici bağlanma miktarının hem de in vivo reseptör yoğunluğunun nicelleştirilmesine olanak tanır. Bu teknik, diğer araştırmacıların röntgen görüntüleme kılavuzlu floresan tomografi sistemleri tasarlamasına ilham vermiş ve daha büyük hayvanların tüm vücut görüntülemesinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, kanser biyobelirteç görüntülemesi için röntgen anatomik görüntüleme ve optik görüntüleme sistemlerini birleştiren difüz floresan tomografi deneyinin nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.