CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Bu bir Max MIDI mıknatıstır. Üzerinde, dikkat aşırı güçlü manyetik alanlar yazmaktadır. Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Irvine Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Mike Collins laboratuvarından Melanie Matthew.

Bugün size Milton Biotechnology kitlerini kullanarak CD4 pozitif T hücrelerinin negatif seleksiyon hazırlığını göstereceğiz. Burada Minimax ve MiniMax mıknatısları bulunuyor; Minimax daha büyük ayırmalar için kullanılır. Minimax'e uygun bir kolon aracılığıyla 10⁹ hücreye kadar işlem yapabilirsiniz; MiniMax ise çok daha küçük hücre hacimleri için kullanılır.

Böylece, pozitif veya negatif ayrıştırma yapıp yapmadığınıza bağlı olarak, hücrelerinizi uygun antikorla etiketleyeceksiniz. Bunların üzerinde, mıknatısa bağlanacak manyetik boncuklar bulunur. Negatif seçilim durumunda, ilgilendiğiniz hücreler kolondan geçecek ve hücrelerinizi içeren elüatı toplayabileceksiniz.

Bu gece size gösterdiğim tekniklerin steril olmadığını belirtmeliyim. Bu nedenle, bu hücreleri hücre kültürü için kullanmak istiyorsanız, her şeyi doku kültürü kabininde steril aletlerle yapmalısınız. CD4 pozitif T hücreleri için bir hazırlık gösteriyor olsam da, bu tekniklerin çoğu Miltenyi Biyoteknoloji kitleri kullanılarak diğer hücre tiplerinin saflaştırılmasında da uygulanabilir.

Tamam, farenin lenf nodlarını çıkardım; bunu nasıl yapacağınızı JoVE'un yedi numaralı sayısındaki iki foton görüntüleme için lenf nodu hazırlama bölümünde detaylı olarak gösteriyorum. Şimdi lenf nodlarını 70 mikronluk bir hücre süzgeci içinde tek hücreli süspansiyon haline getirmek için ezeceğim. Tamam, şimdi altı mililitrelik bir şırınganın arkasını kullanarak lenf nodlarını tek hücreli süspansiyona dönüştüreceğim.

Lenf düğümleri bir filtre içinde RPMI ortamındadır ve uygun bir tek hücre süspansiyonu hazırlamak önemlidir. Bunu bir filtre içinde yapmamızın nedeni, hücre kümelerinin oluşmadığından emin olmak istemenizdir. Ezme işlemi bittiğinde, filtreyi medyumdan çıkaracağım ve ardından süzgeçten geçen hücreleri ve tek hücre süspansiyonunu kullanacağım.

Öğütme işlemi sırasında, dokunun tamamının mümkün olduğunca parçalandığından emin olmalısınız. CD4 pozitif T hücrelerini saflaştıracağımız şey bu tek hücre süspansiyonudur. Tamam, dokuyu öğütme işlemini bitirdim ve lenf düğümlerinin çoğunun neredeyse tamamen yok olduğunu görebilirsiniz.

Hâlâ burada bazı küçük yağ parçaları ve altı lenf nodunun tamamından birbirine yapışmış, az miktarda bağ dokusu içeren bir lenf nodu kabuğu şeklinde yapılar var. Şimdi hücre süzgecini çıkarıyorum. Burada medyumun oldukça bulanık olduğunu görebilirsiniz.

Filtreden maksimum sayıda hücre elde etmek için tek hücreli süspansiyonla doldurulmuştur, çünkü bazıları filtreye yapışacaktır. Birkaç ml besiyeri ile yıkıyorum ve ardından tüm besiyerini 15 ml'lik Falcon tüpüne pipetleyerek, hücreleri daha sonraki saflaştırma işlemi için peletlemek amacıyla santrifüj ediyorum. İşte 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edilmiş ve peletlenmiş tek hücreli süspansiyonum.

Tek hücre süspansiyonunuzda yüksek sayıda ölü hücre olacağını düşünüyorsanız, Miltenyi'den ölü hücre uzaklaştırma kitini kullanmanız faydalı olacaktır. Şimdi, hücreleri pelletledikten sonra medyumu döküp eritrosit lizizi yapacağım, ardından hücreleri sayıp bu spesifik hücreler üzerinde CD4 pozitif T-hücresi negatif seçilim kiti uygulayacağım. Tamam, şimdi RBC lizizi yapıyorum.

Lenfositlerle birlikte çökelttiğimiz kırmızı kan hücrelerini, önce su ekleyerek ve ardından 10X-D-B-P-S ekleyerek çözeltiyi tekrar 1x çözeltiye getirerek osmolariteyi düşürüp liz edeceğiz. Lenfositlerimiz osmolarite değişimine kırmızı kan hücrelerinden daha dayanıklıdır, ancak yine de hızlı çalışmamız gerekir, aksi takdirde istemediğimiz bir durum olan lenfositlerimizi de liz ederiz. Hızlı çalışmanın bir parçası da, sisteme suyu eklemeden önce liz için ihtiyaç duyacağım hacimleri önceden hazırlamaktır.

Lenfositlerimi lizlemediğimden emin olmak ve kırmızı kan hücrelerini lizlemek için, suyu ekledikten birkaç saniye sonra 10 X-D-B-P-S eklemek istiyorum. Bu nedenle 900 µL su ve 100 µL 10 X-D-B-P-S alıyorum.

Her iki pipet de hazır. Lizis aşamasında, suyu ekliyorum, birkaç saniye bekliyorum, tüpü biraz sallıyorum ve ardından 10 X-D-B-P-S ekleyip tüpü biraz daha sallıyorum. Eğer liziz ettiğiniz çok fazla alyuvar varsa, kırılmış tüm hücre membranlarından oluşan büyük, amorf bir kütlenin oluştuğunu göreceksiniz.

Burada biraz örneğimiz var ve parçalanmış hücre membranları olduğunu görebilirsiniz. Lizis işlemini tamamladıktan sonra, pipetleme sırasında herhangi bir hata yapılmış olma ihtimaline karşı, osmolaritenin doğru olduğundan emin olmak ve lizis sürecinin daha fazla ilerlemesini önlemek için hücrelere birkaç ml besiyeri eklemeyi tercih ediyorum. Tamam, şu anda lenfositlerim tek hücre süspansiyonu formunda.

Tekrar, eritrosit lizini gerçekleştirdim ve şimdi hücreleri santrifüj ederek çöktüreceğim. Bunu yapmadan önce, CD4 pozitif T hücresi negatif seçilim kiti için ne kadar antikor eklememiz gerektiğini belirlemek amacıyla hücreleri hemositometre ile sayacağım. Tamam, şimdi hücreleri Max buffer içerisinde santrifüj ediyorum ve RBC lizini yaptıktan sonra peletin çok daha beyaz olduğunu görebiliyorsunuz.

CD4 pozitif T hücreleri için negatif seleksiyon yapacağım. Bu nedenle, hücreleri çöktürmek için kullandığım tüm medyumları ve tüm MACS tamponunu dökeceğim. Ardından, CD4 pozitif T hücrelerinin negatif seleksiyonundaki birinci adım olan biotinli antikor kokteyli ile etiketleme işlemini gerçekleştireceğim.

Ardından, buzdolabında 10 dakika boyunca inkübe ediyorum. Tamam, böylece hücrelerimin ilk inkübasyon süreci tamamlanmış oldu. Şimdi, antibiyotikli mikroboncukları ekleyeceğim ve bunları tekrar 15 dakika boyunca buzdolabına koyacağım.

Bu özel hücre ayırma işlemi için, Miltenyi Biotec'den bir LS kolonu kullanıyoruz ve yapacağımız işlem, kolonu manyetik tutucuya yerleştirip içinden 3 mL MACS tamponu geçirerek kolonu hazırlamak olacak. Kolonu açacağız ve dişlerin mıknatısa doğru içe bakacak şekilde yerleştireceğiz. Şimdi kolona MACS tamponunu ekleyeceğim; tamponun LS kolonundan aşağı indiğini ve alttan damlamaya başladığını görmelisiniz. Kolonun kuruması konusunda endişelenmeyin.

Sıvının yüzey gerilimi, hücrelerinizi ekleyene kadar kurumasını önleyecektir. Hücrelerinizi eklemeden önce, max tamponun kolon boyunca tamamen süzülmesini sağlamak önemlidir. Tamam, biotinli manyetik boncuklar, hücreler ve max tampon ile yaptığım 15 dakikalık inkübasyonun ardından, tamponu dökeceğim ve onları hücre sayımıza uygun bir tampon miktarı içinde yeniden süspande edeceğim.

Bu nedenle, bunun için milli tiny protokolünüzü kontrol etmeniz gerekecek. Ardından, bunları az önce max buffer ile duruladığımız kolona uygulayacağım. Şimdi hücre süspansiyonunu kolona ekleyeceğiz.

Bu bir negatif seçilim kolonu olduğu için, kolonun içinden akıp geçen hücreleri toplayacağız ve bu durumda bunların tamamının CD four pozitif T hücreleri olması gerekir. Şimdi kolonu 12 ml max tamponu ile yıkayacağım ve yine, yalnızca CD four pozitif T hücrelerini içermesi gereken elüatları toplayacağım. Şimdi CD four pozitif T hücrelerini santrifüjle çöktüreceğim, yeniden süspande edeceğim ve ardından tau görüntülemesi için kullanacağım uygun boya ile işaretleyeceğim.

Ayrıca, saflaştırdığım hücrelerden küçük bir örnek alacağım; bunları anti CD3 ve anti CD4 ile işaretleyip, CD4 pozitif T hücrelerinden oluşan temiz bir popülasyona sahip olduğumdan emin olmak için FACS'te analiz edeceğim. İşte az önce santrifüj ettiğimiz hücrelerin görünümü. Bunların saf CD3, CD4 pozitif T hücre popülasyonu olması gerekir.

Böylece size CD4 pozitif T hücreleri için negatif seçimi göstermiş oldum. Miltenyi Biotec kiti kullanarak, bu hücreleri bir fareye adoptif olarak transfer edeceğiz ve bunları kendi T-hücresi ve makine deneylerimizden birinde kullanacağız. Kendi deneylerinizde başarılar dilerim.