Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Bu prosedürün genel amacı, bir substrat üzerindeki hücre adezyonunun topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmektir. Bu işlem, öncelikle şeffaf cam lamlar üzerinde hücrelerin kültüre edilmesi ve floresan bir işaretleyici ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, mikroskobun ayarlanabilir aynasının açısal konumu kalibre edilir ve bu konum ayna konumlandırma programına kaydedilir.

Bir sonraki adım, yaklaşık 10 farklı açıda ışınlama sonrası floresan görüntülerini kaydetmektir. Son adım ise hücre-substrat mesafelerini birkaç nanometre hassasiyetle hesaplamaktır. Nihayetinde, substrat üzerindeki hücre adezyonunun topolojisine ilişkin sonuçlar, örneğin kanser hücreleri ve daha az malign hücreler gibi çeşitli hücre hatları arasındaki adezyon farklarını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gerçek çözünürlüğün yalnızca birkaç nanometre aralığında olmasıdır. Bu yöntem hücre membranları hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, küçük veziküller veya nanomalzemeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Deneyi, hücre örneklerini hazırlayacak olan doktora sonrası araştırmacımız Petra ve deneyi yürütecek olan mühendisimiz Michael Wagner gerçekleştirecektir. Değişken açılı, toplam internal yansıma floresan mikroskopi için hücreleri hazırlamak amacıyla, tekil hücreleri %10 fetal kalfa serumu ve antibiyotiklerle desteklenmiş kültür ortamında, cam lam üzerine milimetrekare başına 100 hücre yoğunluğunda ekiniz. Hücreleri, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 72 saat boyunca büyütün.

Ardından, hücrelere kültür ortamında 8 µM konsantrasyonunda floresan membran belirteci 6-DAPI (decano two, dimethyl amino naphthalene) veya lorane uygulayın ve floresan mikroskopisi öncesinde 60 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın; ortamı uzaklaştırmak için tampon çözeltiyi nesne lamının üzerine pipetle aktarın, ardından nesne lamının arka yüzündeki tampon çözeltiyi silerek temizleyin. Değişken açılar için, arka aydınlatmalı ve or exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış Zeiss Axio plan gibi dik bir mikroskop kullanılır.

T-I-R-F-M sisteminde kondansatör, nesne lamına optik olarak bağlanmış hemi silindirik bir cam prizmaya sahip özel yapım bir aydınlatma cihazı ile değiştirilir. Lazer ışını, kolime edilmiş tek modlu bir fiberden gelir; bu ışın, cam prizma ve diğer optik bileşenler tarafından görüntülenen ardından örnek yüzeyinde tekrar paralel bir ışına dönüşür. Elektrik alan vektörünün, geliş düzlemine dik olacak şekilde polarize edildiğinden emin olun.

Bu konum, fiberin çıkış kuplörü üzerinde işaretlenmiştir. Kondansatörün içinde yer alan, örnek düzleminde görüntülenen ve örneği değişken bir geliş açısı veya nesne ışını altında aydınlatan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Ayarlanabilir ayna, yazılımla kontrol edilen bir step motor tarafından sürülebilir.

Her bir konum, go metrikle gerçekleştirilen ölçümlerle belirlenen tanımlı bir geliş açısına karşılık gelir. Ayarlanabilir aynanın açısal konumunu kalibre etmek için, suda çözünmüş bir milimolar flavin nükleotid gibi floresan bir boya kullanın. Geliş açısı varyasyonuna bağlı olarak kritik açıyı görselleştirmek için, cam-su geçişi için 61,3 derecelik kritik açıyı sabit bir değer olarak kullanın; geliş açısının kritik açıya eşit olduğu aynanın açısal konumu, ayna konumlandırma programına kaydedilir.

Kamera yazılımını kullanarak, sıcaklık kazancı, kayıt süresi ve kaydırma hızı dahil olmak üzere E-M-C-C-D kamerasının parametrelerini ayarlayın. Numunenin optik temasını sağlamak için imersiyon yağı kullanın. Cam bir prizma ile, hücreler için uygun büyütme oranına ve orta seviyede sayısal açıklığa sahip bir objektif lens seçin.

Nesneyi mikroskop altında görüntülemek için, floresan deteksiyonuna uygun bir uzun geçiren veya bant geçiren filtre kullanın. Aydınlatma açısının değiştirilmesi üzerine özdeş örneklerin floresan görüntülerini kaydedin. Geliş açıları, kritik açıya eşit veya ondan daha büyük olmalıdır.

Hücre-cam ara yüzü için kritik açının 64,5 derece olması nedeniyle, 0,5 derecelik veya bir derecelik adımlarla 66 derece ile 74 derece arasında bir açı aralığı önerilir. Veri analizine başlamak için, çeşitli açılarda kaydedilen görüntülerin yanı sıra kamera ayarlarını, eksitasyon dalga boyunu ve kırılma indekslerini okumak için lab view programını kullanın. Verilerin uygun şekilde değerlendirilmesi için cam için 1,52 ve hücreler için 1,37 olan ayarlar içe aktarılır.

Her bir parametre seti için, prosedürün başarısı adına penetrasyon derinliği ve transmisyon faktörü otomatik olarak hesaplanır. Görüntülerin dikkatle kaydedilmesi ve analiz için seçilmesi önemlidir. Hücre-substrat mesafelerinin değerlendirilmesinde kullanılacak görüntüleri denklem doğrultusunda seçiniz.

Bir membran işaretçisi için, bu örnekte gösterildiği gibi, homojen aydınlatmaya sahip bireysel görüntüler hariç tutulabilir. Hücre substrat topolojisinin görüntülerini hesaplayın ve değerlendirme sırasında görüntüleme için uygun bir renk kodu seçin. Bireysel piksellerin profilleri, bu şekilde tasvir edildiği gibi görüntülenebilir.

Bu profiller, uyumun kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. Son olarak, değerlendirme protokolünü kaydedin. Bu şekil, aktive edilmiş bir TP 53 tümör baskılayıcı gene sahip U2 51 mg glioblastoma hücrelerinin toplam internal yansıma görüntülerini betimlemektedir.

Çeşitli geliş açılarıyla kaydedilen inkübasyon sonucunda, yaklaşık 140 nanometrelik bir evanesan elektromanyetik alan penetrasyon derinliğine karşılık gelen 66 derece, 75 nanometrelik bir penetrasyon derinliğine karşılık gelen 69 derece ve azalan penetrasyon derinliği ile 60 nanometrelik bir penetrasyon derinliğine karşılık gelen 73 derecede, floresans yoğunluğu azalmakta ve hücrelerin kenarlarındaki fokal temaslar gibi daha yüzeysel bölgelerden kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri, Panel D'de burada görüldüğü üzere sıfırdan 600 nanometreye kadar değişen bir renk kodu ile betimlenmiştir.

Hücre-substrat mesafeleri, beyazdan sarıya kadar temsil edilen yalnızca birkaç nanometre ile koyu kırmızı ile temsil edilen 250 ila 300 nanometre arasında, hücreler genelinde büyük farklılıklar göstermektedir. Bu durum, fokal temasların ve daha geniş hücre-substrat mesafelerinin birbirine yakın olduğunu göstermektedir. Benzer bir hücre-substrat mesafe varyasyonu, aktive edilmiş bir tümör baskılayıcı gene sahip P 10 U2 51 mg glioblastoma hücreleri için hesaplanmıştır.

Buna karşılık, hücre-substrat mesafeleri, sarı ile temsil edilen U2 51 mg kontrol hücreleri ve turuncudan kırmızıya temsil edilen vahşi tip hücreler için gelişimden sonra oldukça sabittir. Bu teknik, hücre-substrat topolojisi alanındaki araştırmacıların tümör hücrelerini ve lazer terapisi sonrası morfolojik değişiklikleri incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı organizmalar tarafından iyi tolere edilen düşük ışık maruziyeti altında, nanometre aralığında gerçek bir çözünürlükle yüzeylerin nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.