Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerden çıkarılan fonksiyonel nükleer mekanizmalar kullanılarak gen ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle HeLa hücrelerinin hasat edilip şişirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından hücreler çöktürülerek açılır ve üçüncü adımda çekirdekleri peletlemek için santrifüj edilir.

Suda çözünür ve fonksiyonel gen ekspresyon mekanizmaları elde etmek amacıyla çekirdekler tuzla ekstrakte edilir, konsantre edilir vele diyalize edilir. Nihayetinde, nükleer ekstraktların fonksiyonelliği, RNA polimeraz ile eşleştirilmiş bir transkripsiyon ve splicing sistemi ile değerlendirilen transkripsiyon ve splicing aktivitelerine dayanarak analiz edilebilir. Bu tekniğin, dökme nükleer ekstrakt hazırlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nükleer ekstrakt hazırlamak için az miktarda hücrenin kullanılabilmesidir.

FBS ve antibiyotikler ile desteklenmiş DMEM besiyerini kullanarak HeLa hücrelerini üç adet 150 milimetrelik plağa ekerek başlayın; kültürleri, hücreler %90 konfluens seviyesine ulaşana kadar %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde büyütün. Bu noktada, HeLa hücre kültürlerindeki besiyerini aspire edin ve her plak için 13 mililitre oda sıcaklığındaki PBS ile bir kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin. Her plağı birkaç saniye yan tutun ve kalan PBS'yi aspire edin.

Ardından, hücreleri her plağın alt kenarına sıyırmak için bir hücre kaldırma aparatı (cell lifter) kullanın ve ardından hücreleri 1,5 mililitrelik bir einor tüpüne çekin. Son olarak, hücreleri bir mikrosantrifüjde beş dakika boyunca 100 ×g'de ve 4 °C'de çöktürün. Şimdi hücre peletindeki PBS'yi aspire edin ve tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak paketlenmiş hücre hacmini veya PCV'yi tahmin edin.

Ardından, hücre pelletine PCV hacminin iki katı kadar hipotonik tampon ekleyin. Yeniden süspansiyon oluşturmak için tüpü nazikçe çalkalayın. Hücre kümelerini çözmek için gerektiği şekilde, hücre süspansiyonunu 1000 mikrolitrelik bir pipetle nazikçe aşağı yukarı pipetleyerek hücreleri ayırın.

Ardından hücreleri daha öncekiyle aynı santrifüj koşulları altında çöktürün. Santrifüjden sonra hipotonik tampon tabakasını dikkatlice aspire edin. Hücreler şişmeye başlamış olacak ve hücre hacmi yaklaşık 750 ila 1000 microliters değerine çıkacaktır.

Son hacim 1,5 mililitre olacak şekilde yeni hipotonik tampon ekleyin ve hücreleri tampon içerisinde tekrar süspande edin. Son olarak, soğutulma işlemi sırasında süspande edilmiş şişmiş hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bir homogenizer'ı hipotonik tampon ile durulayın ve ardından hücrelerle birlikte buz üzerine yerleştirin.

Ardından, Kim wipe gibi hassas bir temizleme mendili kullanarak havanı kurulayın. Alt kısımdaki tamponu uzaklaştırmak için 1000 µL'lik uzatılmış bir mikropipet ucu kullanın. Şimdi, soğutulmuş şişmiş hücreleri alt kısma aktarmak için pipeti kullanın.

Bu prosedürün başarısı için en kritik nokta lizisin kontrol edilmesidir. Her bir örneğin mikroskop altındaki incelemesinden sonra, hücreleri liz etmek için örneğin sıkı havan deliğini yavaşça beş kez yukarı aşağı hareket ettirin ve bu sırada hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, liz edilmiş hücre süspansiyonundan 5 µL alarak bir ependorf tüpüne aktarın ve üzerine 10 µL trypan blue ve 15 µL 1X PBS ekleyin.

Hücre solüsyonunu bir lama ekleyin ve hücreleri bir ışık mikroskobunda lizis açısından inceleyin; liz olmuş hücrelerin çekirdekleri üç saat sonra mavi görünecektir. Çok sayıda canlı hücre görüldüğü için lizis yeterli değildir. Beş saat sonra lizis yeterli düzeye ulaşmıştır.

Son olarak, lizlemiş hücreleri önceden soğutulmuş eppendorf tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüjde 1500 ×g ve 4 °C'de beş dakika boyunca çöktürün. Ardından, pelletten rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Şimdi, tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak toplam nükleer hacmi veya PNV'yi tahmin edin.

Bir mikropipet ucunu, PNV'nin yarısı kadar düşük tuzlu tampon çözelti ile doldurun. Ardından, mikropipet ucunu eppendorf tüpünün dibindeki çekirdeklerin içine yerleştirin. Nazikçe karıştırırken, tampon çözeltiyi çekirdeklerin içine yavaşça püskürtün.

Peletin tamamen süspanse olduğundan emin olmak için tüpe hafifçe vurun. Ardından, PNV'nin yarısı kadar yüksek tuzlu tampon ekleyin ve tüpü bir kez ters çevirerek hızlıca karıştırın. Tüpü dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca döndürün.

Son olarak, çekirdekleri mikro santrifüjde 18,000 ×g'de ve 4 °C'de 15 dakika boyunca çöktürün. Süpernatantın 500 µL'sini soğutulmuş mikro konsantrasyon tüplerine aktararak başlayın. Yüksek tuzlu nükleer ekstraktı 14,000 ×g'de ve 4 °C'de 15 dakika boyunca çöktürün; santrifüj işleminden sonra mini raconu ters çevirin ve yeni bir bireysel EOR tüpüne yerleştirin.

1000 ×g ve dört °C'de iki dakika boyunca santrifüjleme işleminden sonra, yüksek tuzlu nükleer ekstrakt yaklaşık 115 µL'ye konsantre olacaktır. Şimdi, yüksek tuzlu nükleer ekstraktın 45 µL'lik alikotlarını mini diyaliz SLI'larına aktarın. Slaytların tabanının floater tabanıyla temas ettiğinden emin olun.

Ardından, SLI'ları 500 mililitre soğutulmuş diyaliz tamponuna yerleştirin. Son olarak, alikotları dört santigrat derecede bir ila iki saat boyunca karıştırın; diyaliz sonrası nükleer ekstrakt bulanık görünecektir. Bu şekil, küçük ölçekli bir nükleer ekstrakt ile dökme (bulk) nükleer ekstraktta eşleşmiş RNA polimeraz iki transkripsiyon ve ekleme reaksiyonunu karşılaştıran temsilci verileri göstermektedir.

A-C-M-V-D-N-A konstrüktü dökme veya küçük ölçekli ekstraktlarda inkübe edildiğinde, yeni sentezlenen pre-mRNA benzer seviyelerde sentezlenmişti; daha fazla transkripsiyonu engellemek için alfa-amanitini eklendikten sonraki beş dakikalık zaman noktasında, splicing ara ürünleri ve splice ürünleri her iki ekstrakt tipinde de benzer kinetiklerle zamanla birikmişti. Bu temsili sonuçlar, eşleşmiş RNA polimeraz II transkripsiyon ve splicing sisteminin verimliliğinin dökme ve küçük ölçekli nükleer ekstraktlarda benzer olduğunu doğrulamaktadır. Küçük ölçekli ekstraktın kullanışlılığını göstermek için, splicing inhibitörü E 7 1 0 7 veya negatif kontrol bileşiği Platyanaly F ile işlem görmüş hela hücrelerinden metod ekstraktları hazırlandı ve ardından bu şekilde gösterildiği gibi bir eşleşmiş RNA polimeraz II transkripsiyon ve splicing testi gerçekleştirildi; RNA polimeraz II ile transkripsiyon, hem Platyanaly F hem de E 7 1 0 7 ile işlem görmüş hücrelerden hazırlanan ekstraktlarda verimli bir şekilde gerçekleşti.

Buna karşın, analy F ile işlem görmüş hücrelerden hazırlanan ekstrede ekleme (splicing) normal şekilde gerçekleşirken, E 7 1 0 7 ile işlem görmüş hücrelerde ortadan kalkmıştır. Bu veriler, hücrelerin küçük ölçekli özel işlemleri için küçük ölçekli nükleer ekstrelerin kullanımına yönelik bir kavram kanıtı sunmaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik beş saatten kısa sürede tamamlanabilir.