Gaz kromatografisi ile operant etanol kendi kendine uygulama ve etanol belirleme sırasında etanol mikrodivaliz

Bu prosedürün genel amacı, bir etanol kendi kendine uygulama oturumu sırasında beyin diyalizatı içindeki etanol seviyelerini izlemektir. Bu ölçümü senkronize kendi kendine uygulama davranışlarıyla karşılaştırabilmek için, öncelikle bir mikrodiyaliz kılavuzu, kanül ve sabitleme cıvatası cerrahi olarak implante edilir ve ardından sıçanların operant yöntemle etanolü kendi kendilerine uygulamaları için eğitim verilir. İkinci adım, mikrodiyaliz sırasında etanol kendi kendine uygulamasının engellenmemesi için sıçanların kafa aşaması sabitleme aparatına alıştırılmasıdır.

Ardından, diyalizatın bir kısmının etanol analizi için hazırlandığı bir etanol kendi kendine uygulama seansı sırasında mikrodiyaliz gerçekleştirilir. Sonrasında, diyalizat örnekleri, alev iyonizasyon dedektörlü bir gaz kromatografı kullanılarak etanol konsantrasyonu açısından analiz edilir. Nihayetinde, elde edilen sonuçlar, bir etanol kendi kendine uygulama seansı sırasında etanolün ilgili beyin bölgesine ulaşma zaman sürecini gösterir.

Bu tekniğin kuyruk veya safen ven ponksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, numune toplama sırasında minimum düzeyde rahatsızlık vermesi ve hayvan bir davranışsal görevi yerine getirirken ilgi duyulan beyin bölgesinde zamanla ilaç ölçümüne olanak tanımasıdır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorlanacaktır çünkü yöntem, çoğu yalnızca tekrarlanan uygulama veya deneyim yoluyla edinilebilen bir dizi uzmanlık becerisi gerektirmektedir. Prosedürü, laboratuvarımızda lisans araştırma asistanı olan Jeffrey Dilley gösterecektir.

Gösterilen tüm hayvan prosedürleri, Teksas Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kılavuzunun tüm düzenlemelerine uygundur. Teksas Üniversitesi Austin kampüsü, ALAC akreditasyonuna sahip bir tesistir; bu davranışsal mikrodiyaliz deneyleri için, ilgi duyulan beyin bölgesinin üzerine 21 gauge kanül cerrahi olarak implante edilmiş olan ve bakımları titizlikle yapılmış long Evans sıçanlar kullanılır. Tüm hayvanlar, aşağıdaki prosedürlere başlanmadan önce en az bir hafta cerrahi sonrası bakım ve iyileşme süreci geçirmeli ve sağlıklı durumda olmalıdır.

Sıçağı, lichter geri çekilebilir manivela ve tipper tüpü ile donatılmış bir med associates operant odasına yerleştirin ve %10 sükroz çözeltisine erişim sağlamak için manivelaya basması yönünde eğitin. Sıçan sükroz çözeltisi için yanıt vermeye eğitildikten sonra, sondan bir önceki operant oturumundan önceki gece, birden fazla içme seansı boyunca çözeltiye kademeli olarak etanol eklendiği uygun bir eğitim programına başlayın. Hayvanı anestezi altına alıp sedasyon seviyesini kontrol ettikten sonra, hayvanı karşı ağırlık manivelası, kol, döner bağlama aparatı (swivel tether), yay ve halkalı standdan oluşan düzeneğe alıştırmak için bağlama yayını sıçağın kafa düzeneğindeki bağlama cıvatasına takın.

Sıçanın, mikrodiyaliz deneyinden önceki gün, operant odasında kendi kafesinde, ad libitum yem ve su ile geceyi geçirmesini sağlayın ve ardından ertesi günkü eğitim oturumunu tether ve ilgili ekipmanlar kurulu haldeyken tamamlayın. Sıçanı izofluran ile anestezi ettikten sonra, ayak parmağı sıkma testi yaparak sedasyon durumunu kontrol edin ve yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüze edilmiş bir mikrodiyaliz probu yerleştirin. Probu uygun şekilde sabitleyin ve ardından prob akış hızını dakikada 0,2 microliters olarak ayarlayın.

Sıçağı, tüm diyaliz ekipmanları kurulu haldeyken, geceyi geçirmesi için operant odasındaki ev kafesine yerleştirin ve ad libitum yem ve su sağlayın. Prob yerleştirildikten bir gün sonra, deney başlamadan en az iki saat önce, probu çalışma akış hızına getirin. Bir Hamilton şırıngası kullanarak, prob akış hızının tutarlı olduğunu ve ayarlanan akış hızının en az %90'ında olduğunu kontrol edin.

Diyaliz örneklerindeki nörotransmitterlerin değerlendirilmesi durumunda, deneyin tüm aşamalarında örnekler alın. Öncelikle, hayvan kendi kafesindeyken diyaliz örnekleri toplayarak başlayın. Örnekleri, daha sonraki analizler için uygun bir şekilde saklayın.

Sıçağırtı yapan sıçanı dikkatlice operan odaya aktarın ve odayı kontrol eden operan programını başlatın. Sıçan, manivela odaya uzanana kadar örnek almaya devam edin; manivela uzanmadan önce iki örnek alın. Her bir diyalizat örneğinin bir kısmını etanol analizi için toplamaya başlayın; bunun için diyalizatın uygun bir alikotunu iki mililitrelik cam bir viyale pipetle aktarın ve viyalı hava sızdırmaz bir septum ile kapatın; etanol örneklerini hızlıca pipetleyin ve mühürleyin.

Etanol uçucudur ve örnek hacmi küçüktür, bu nedenle tutarsız veya yavaş örnek hazırlama süreci hatalı sonuçlara yol açacaktır. Kalan kısmı nörotransmitter analizi için saklayın. 20 dakikalık içme süresi, Med Associates bilgisayar programı kolu hazneye doğru uzattıktan ve sıçan, bir şişe içme çözeltisine erişmek için kola bastıktan sonra başlar.

Tüm içme süresi boyunca örnek almaya devam edin; içme süresi sona erdiğinde bilgisayar programı şişeyi hazneden geri çeker. Mikrodiyaliz deneyinin sonunda, hayvanı içme sonrası ek 20 dakikalık bir süre boyunca hazne içerisinde tutun. Sıçanı anestezi altına aldıktan sonra probu çıkarın.

Hayvan hemen insancıl yöntemlerle ötanize edilmeyecekse, prob yolunun görüntülenmesini sağlamak için obtüratörü yeniden yerleştirin. Beyni, deneyden sonraki üç gün içinde toplayın. Örnekleri; 50 °C'ye ısıtılmış bir headspace otomatik örnekleyici, alev iyonizasyon dedektörlü bir gaz kromatografı ve mobil faz olarak helyum kullanılan bir kapiler kolon yardımıyla, harici etanol standartlarıyla birlikte analiz edin.

Kromatogramları kaydetmek ve analiz etmek için, sistemi etanol analizine hazırlamak üzere kromatografi iş istasyonu yazılımını kullanın. Otomatik örnekleyici plakayı ısıtmak için sirkülasyonlu bir su banyosu kullanın; hava ve hidrojen tanklarını açın. Ardından, başlatma programını çalıştırın.

Hazır olduğunda, fiberi dekontamine eden 20 dakikalık bir yakma işlemi başlatın. 238 µL %95 etanolün su ile nihai hacmi 100 mL olacak şekilde seyreltildiği 100 mL'lik bir balon joje kullanarak standartlar hazırlayın. Standartları oluşturmak için bire bir seri dilüsyon uygulayın.

Standartları cam şişelere pipetleyin ve numunelerin hazırlandığı şekilde aynen mühürleyin. Standartlarınızla birlikte mutlaka bir su körü çalıştırdığınızdan emin olun. Standartları ve numuneleri otomatik örnekleyici tepsisine yerleştirin ve tüm sıvı alikot buharlaşana kadar ısıtın.

Standartları ve örnekleri çalıştırmak için, hangi örneğin hangi otomatik örnekleyici yuvasında olduğunu ve her örneğin delinmesi gerektiğini belirten bir örnek listesi oluşturun. Veri dosyalarını seçilen bir klasöre yönlendirdikten sonra, örnekler için uygun bir yöntem seçin ve çalışmayı başlatın. Sistem örnekleri tamamladıktan sonra, programın her bir piki doğru şekilde entegre ettiğini kontrol edin.

Pik yüksekliğini, her bir bilinen dış standardın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. Etanol konsantrasyonu. Her bir diyalizat örneğinin etanol konsantrasyonunu enterpole etmek için noktalar tarafından verilen doğrusal fonksiyonu kullanın.

Bu şekil, üç farklı konsantrasyondaki etanol standartları için örnek kromatogramları ve etanol kendi kendine uygulama seansının sonunda toplanan bir sıçan diyalizat örneği için bir kromatogram göstermektedir. Etanol pikleri nispeten simetrik olmalı, tutunma süreleri tutarlı olmalı ve sinyal-gürültü oranı 10'dan büyük olmalıdır. Bu kriterlerin karşılanmaması sistemin bakıma ihtiyaç duyduğu anlamına gelir; kaliteli kromatografi ve doğru standartlar, etanol kendi kendine uygulama sürecinde hayvanlardan toplanan diyalizat örneklerinin etanol konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılan doğrusal bir standart eğrisi oluşturur.

Elde edilen diyalizat etanol konsantrasyonları in vivo prob geri kazanımı için düzeltilmemiştir ve beyin etanol doku konsantrasyonunun yalnızca bir kısmını temsil eder. Etanolün kantitatif mikrodiyalizi gerekiyorsa, hücre dışı alandan proba difüze olan etanolün ekstraksiyon fraksiyonu deneysel olarak belirlenir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde yürütülürse yaklaşık dört ila beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu süre, davranışsal oturumun uzunluğuna göre değişiklik gösterecektir. Deneyin mikrodiyaliz aşamasının başarıyla tamamlanması, büyük ölçüde hazırlık aşamalarının kalitesine bağlıdır. Bu prosedürü uygularken, hayvanın kendi kendine uygulama davranışının etkilenmemesi için sıçanlarınızın iyi yönetildiğinden ve diyaliz deneyi sırasında meydana gelebilecek dikkat dağıtıcı tüm uyarılara alıştırıldıklarından emin olmanız önemlidir.