Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik olarak ilgili lipid veziküller için sağlam bir hazırlama yöntemi sunmaktır. Bu işlem, fosfolipidlerin cam şişelerde karıştırılıp aktarılması ve çok lamelli bir SLE süspansiyonu oluşturmak için sulu tamponla hidrate edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, çok lamelli veziküllerden tek lamelli veziküllerin üretilmesiyle sonuçlanan bir dondurma ve çözdürme yöntemi uygulanır.

Ardından, istenen boyutta homojen lipid veziküller üretmek için lipozom süspansiyonu, belirlenen optimal basınç kullanılarak bir ekstrüderden geçirilir. Dinamik ışık saçılması ve nanoparçacık izleme analizine dayalı olarak, tutarlı alt mikron vezikül boyutları elde edilmiştir. Bu tekniğin sonikasyon ve sedimentasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, verimli lipid vezikül boyutu hazırlama işlemi için optimal olarak belirlenmiş azot akış hızlerine sahip bir basınç kontrol sistemi kullanmasıdır.

Bu prosedüre başlamak için, Teflon kapaklı 20 mililitrelik bir cam şişe temin edin; kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce tüm cam malzemeleri ve şırıngaları kloroform ile temizleyin. 250 mikrolitrelik hava sızdırmaz bir cam şırınga kullanarak cam şişeye 100 mikrolitre ayırıcı kalitede kloroform aktarın. 100 mikrolitrelik hava sızdırmaz bir cam şırınga kullanarak aynı cam şişeye 30 mikrolitre ayırıcı kalitede metanol ekleyin.

216 µL 10 mg/mL Pop C, 42 µL 10 mg/mL Pop E ve 20 µL 11 mg/mL kolesterol solüsyonlarını 20 mL'lik cam şişeye aktararak iki milimolar Pop C-Pop E-kolesterol lipid solüsyonu hazırlayın. Şişenin dibinde ince bir lipid tabakası gözlemlenene kadar organik çözücüleri yavaş akışlı argon veya azot gazı kullanarak uçurun; kapağı açık cam şişeyi en az 30 dakika boyunca vakumlu desikatöre yerleştirin.

Kalıntı çözücüyü uzaklaştırmak için, daha önce 0,2 mikronluk filtreden geçirilmiş iki mililitre tamponu lipidleri hidrat etmek üzere cam şişeye aktarın. Karışımı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin ve 30 ila 100 nanometre lipozom boyutları için 48 saat içinde kullanın. Lipozom süspansiyonunu sıvı nitrojen içerisinde 15 saniye boyunca dondurun.

Ardından, lipozom süspansiyonunu bir ısıtma bloğu kullanarak 42 °C'de yaklaşık üç dakika boyunca çözdürün. Dondurma-çözdürme işlemini toplam beş döngü olacak şekilde tekrarlayın. Dondurma ve ardından çözdürme işlemi, çok katmanlı veziküllerden tek katmanlı veziküller oluşturur ve ekstrüzyon sırasında lipid hapsetme verimliliğini artırır.

Ardından, Lipo-so-fast LF 50 ekstrüderi dikkatlice monte etmek için Avastin talimatlarını izleyerek ekstrüzyon hazırlıklarını yapın. Azot sızıntısını önlemek için doğru montaj kritik önem taşır; çünkü sızıntı, istenen akış hızlarını etkiler. Başarıyı sağlamak için aşağıdaki adımları dikkatle uygulayın.

Hava sızdırmaz bir conta oluşturmak için; önce geniş delikli destek süzgecini destek filtre tabanına yerleştirin, ardından dairesel merkez tepsisini, bir adet drenaj diskini ve bir adet polikarbonat membranı ekleyin. Küçük siyah O-ringi membranın üzerine yerleştirin ve destek filtre tabanına sabitleyin.

Dört karşılık gelen deliğe dört vidayı sıkarak üst filtre ekstrüderini takın. Filtre ekstrüder ünitesini büyük ekstrüder namlusunun altına monte edin. Ekstrüzyon namlusunun üzerindeki silindir namluya lipozom çözeltisini ekleyin.

Büyük dairesel bir O-ring, dar kapak, büyük dairesel O-ring ve dairesel kapak yerleştirin. Gaz regülatörünü ekstrüder namlusunun üst kısmına takın ve basınç tahliye valvi dahil tüm valfleri hava sızıntısını önlemek için kapatın. Ekstrüder filtre ünitesinin altına 20 mililitrelik bir cam şişe veya 50 mililitrelik bir erlenmeyer flask yerleştirin.

Regülatöre bir emniyet valfi bağlıdır ve basınç 600 PSI değerini aşarsa tahliye sağlayacaktır. Azot gazını açarım ve ekstrüdere bağlı gaz valfini açarım. Azot basıncını, 400 nanometre lipozomlar için 25 PSI'ye, 100 nanometre lipozomlar için 125 PSI'ye ve 30 nanometre lipozomlar için 400 ila 500 PSI'ye yükseltirim. Lipozom süspansiyonu, azot tarafından itilerek kaba boşalana kadar izlenir.

Sıvı gözlemlenmeyene kadar azot akışını sürdürün. DLS analizi yapmak için ekstrüder filtresinden cam tüpe geçirin. İlk olarak, fosfat tamponlu salin veya PBS içinde seyreltilmiş 20 micromolar'lık lipozom çözeltisinden 50 microliter hazırlayın.

Ardından güç kaynağını ve lamba kaynağını açın. Dynapro yazılımını açma işlemine geçin. Yazılımı, istenen boyuttaki lipozomları tespit etmek için uygun algoritma modeline ayarlayın.

Donanıma bağlandıktan sonra, kuartz küvete 14 µL lipozom örneği pipetleyin ve hücre tutucuya yerleştirin; başlat düğmesine basın, yaklaşık 20 ila 30 veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra durdur düğmesine basın. Histogramda kaydedilen ortalama lipozom çapı piklerini analiz edin. Nanopartikül izleme analizi, PBS içerisinde çözünmüş 500 µL 0.1 µM lipozom çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar; örnek bölmesini su ve etanol ile durulayın.

Ardından örnek bölmesini tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile kurulayın. Lazer güç kaynağını ve bilgisayarı açarak örnek bölmesine 300 µL 0.1 M lipozom çözeltisi aktarın. Sıcaklık kontrolünü ve nanoparçacık izleme analizi yazılımını açın.

Lazeri açmak için yakalama düğmesine basın. Sahneyi hareket ettirmek ve mikroskop odağını ayarlamak için yatay ve dikey ayarları kullanın. İstenen sıcaklığı ve kayıt süresini ayarlayın.

Belirlenen bir süre boyunca lipozom partiküllerinin birden fazla görüntü karesini yakalamak için kayıt düğmesine basın. Her bir partikülün hareketini takip eden histogram üzerindeki lipozom çap boyutlarına karşılık gelen pikleri analiz edin. DLS, partikül çapını belirlemek için saçılan ışığı toplayan yerleşik bir yöntemdir ve lipozom boyutlarını belirlemek için uygulanmıştır.

Hidrate lipozomlar, yazılı protokolde açıklandığı üzere çeşitli boyutlarda ve basınçlarda polikarbonat membranlardan ekstrüde edildi. DLS ile ölçülen lipozom çapları, 30 nanometre gözenek boyutu için 66 ± 28 nanometre idi. 100 nanometre gözenek boyutu için 138 ± 80 nanometre ve 400 nanometre gözenek boyutu için 360 ± 25 nanometre idi.

Kalibrasyon standardı olarak 50 nanometrelik cilalanmış Irene boncuklarının bir süspansiyonu kullanılmış ve 47 ± 16 nanometre çap kaydedilmiştir. Polidispersite yüzdesi, lipozom boyutları arasında bir örtüşme olmadığını göstermektedir. DLS analizinde, bu cihazın büyük parçacıklara karşı sahip olduğu bilinen eğilim nedeniyle 30 nanometreden daha büyük çapların gözlemlenmesi tipiktir.

Bu enstrümantal kısıtlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi doğrusal bir korelasyon tanımlamaktadır. Nanopartikül takip analizi, parçacık kırılma indisi veya yoğunluğundan bağımsız olarak, sıvı bir ortamdaki difüzyonun doğrudan gözlemlerinden yola çıkarak her bir parçacığın boyutunu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu yüksek çözünürlüklü teknik, lipozomların DLS ile yapılan ölçümlerini tamamlamak için kullanılabilir; kalibrasyon için kullanılan iki adet 100 nanometre ve 400 nanometre polistiren çözeltisi için NTA tarafından kaydedilen çaplar sırasıyla 95 ± 48 nanometre ve 356 ± 51 nanometredir.

Lipid çözeltileri, DLS ile karşılaştırılabilir çaplara sahiptir ve 30 nanometre gözenek boyutu için 29 ± 14 nanometre, 100 nanometre gözenek boyutu için 95 ± 17 nanometre ve 400 nanometre gözenek boyutu için 359 ± 73 nanometre ortalama boyutlar üretmektedir. NTA, duyarlılığı 50 ila 1000 nanometre arasındaki partiküllerin ölçülmesine olanak tanıdığı için mikroskobik partikülleri nicelendirmek adına daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir. Kalibrasyon eğrisi, polikarbonat membran gözenekleri ile kaydedilen NTA çapı arasında doğrusal bir korelasyon göstermektedir. Negatif boyama iletim elektron mikroskobu görüntüleri, ekstrüzyon sonrası 3, 100 ve 400 nanometre olan her bir lipozom boyutunun birbirinden açıkça farklı olduğunu göstermektedir.

Büyütme 25.000 kat olarak ayarlanmış olup ölçek çubuğu 0,5 mikronu temsil etmektedir. Üç farklı lipozom boyutu ile bir zaman seyri deneyi yürütülmüştür. Ekstrüzyonun hemen ardından her bir lipozom çözeltisi için DLS ölçümü yapılmıştır.

Tüm lipozom çözeltileri dört derece Celsius'ta gece boyunca saklanmıştır. Gece boyu süren inkübasyonun ardından çapları DLS ile tekrar kaydedilmiştir. 60 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra çok az değişim gözlemlenmiş veya hiç değişim gözlemlenmemiştir. Bu prosedür uygulanırken, ekstrüzyon filtresinden birden fazla kez geçirilmenin vezikül çözeltisi homojenliğini artıracağını unutmamak önemlidir.

Ayrıca, kloroformun polipropilen tüplerden sızıntı yapması sonucu oluşabilecek kontaminasyonu önlemek için numune hazırlama aşamasında cam vialler ve şırıngalar kullandığınızdan emin olun.