Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, şişirilmiş akciğer mimarisini korurken fare akciğerindeki mikro metastazların ex vivo tespitini iyileştirmektir. Bu, öncelikle dokudaki temel renk arka planı kaynağı olan kanı uzaklaştırmak için akciğerin in situ olarak PBS ile perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, PFA enjeksiyonu ile akciğerin şişirilmesi ve ardından akciğer dokusunu şişmiş halde sabitlemek için uç kısmın sıkıştırılmasıdır.

Ardından, akciğer çıkarılır ve PFA ile daha fazla fikse edilir veya tekil akciğer lobları kriyoseksiyon için gömülür. Son adımlar, dokuların Xal solüsyonunda boyanması ve LA zag tümör hücrelerinin görselleştirilmesidir; sonuç olarak, tüm akciğer loblarında veya akciğer doku kesitlerindeki metastazlar, binoküler mikroskop veya ışık mikroskobu ile tek hücre seviyesine kadar tespit edilebilir. Bu tekniğin, kendi başına ayakta duran gökyüzü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kanla ilişkili arka planın giderilmesi sayesinde mikro metastazların tespit edilebilirliğinin önemli ölçüde artmış olmasıdır.

Protokole, bir fareye yaklaşık 150 µL PBS içinde ketamin, ksilazin ve asepromazin içeren intraperitonal bir enjeksiyon yaparak anestezi uygulayarak başlayın. Farede ağrı refleksleri gözlemlenmediğinde, fareyi ameliyat masasına sabitleyin. Sırt bölgesini aşağı doğru tarayın ve tüyleri %70 etanol ile düzeltin.

Karnın alt kısmından boyuna kadar deriyi açın. Deriyi yanlara doğru çekin veya tamamen çıkarın. Vena jugularis gibi büyük damarların yırtılmasını önlemek için torakstaki peritonyumu dikkatlice açın.

Bu, perfüzyonun verimliliğini artıracaktır. Şimdi, 21 ila 24 gauge iğneye sahip 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğerin altındaki vena cava cardis'i kesin. Akciğer tamamen beyazlaşana ve kalp atışları durana kadar atan kalbin sağ ventrikülüne yavaşça 10 ila 15 mililitre PBS enjekte edin.

Ardından, karaciğerin üzerindeki kan damarlarını ve diyaframı vasküler bir klemple sıkıştırın. 10 mililitrelik bir şırıngayı %3 paraformaldehit ile doldurun ve 21 ila 24 gauge bir iğne ile sağ ventriküle enjekte edin. Yaklaşık iki mililitre.

Toraksın dışındaki trakeayı açığa çıkarın ve toraks dışından trakeaya yaklaşık üç mililitre aldehit enjekte ederek akciğeri şişirin. Ardından, iğneyi çıkardıktan hemen sonra trakeayı ponksiyon bölgesinden vasküler bir klemple sıkıştırın ve fiksasyonun gerçekleşmesi için 10 dakika bekleyin. Son olarak, vasküler klempin üstündeki kan damarlarını kesin.

Ardından klempi çıkarın ve fazla formaldehiti uzaklaştırmak için sağ ventriküle yaklaşık iki mililitre PBS enjekte edin. Tüm akciğer loblarının alt kısımlarını bir iğne ile delin ve trakeadaki vasküler klempi kaldırın. Şimdi, diğer enjeksiyona paralel olarak trakeaya üç ila beş mililitre seyreltilmiş gömme solüsyonu enjekte edin.

Paraformal ehid akciğer loblarında solüsyonla yer değiştirdiğinde enjeksiyonu durdurun. Kalbi bir pensle çekerek ve bağ dokusu ligamentlerini, kan damarlarını ve trakeayı keserek akciğeri dikkatlice çıkarın. Kalbin akciğerlere bağlı kaldığından emin olun.

Bir lobu kriyoseksiyonlar için ayırın ve geri kalan akciğer dokusunu tüm akciğer boyaması için kullanın. Akciğeri sıkı kapanan kapaklı plastik bir kaba yerleştirin ve %2 formaldehyde ve PBS ile fikse edin. Akciğeri solüsyonun içinde tutmak için üzerine bir parça gazlı bez koyun ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.

Yarım saat sonra fiksasyon solüsyonunu uzaklaştırın ve dokuyu PBS ile 3 kez iyice yıkayın; bir mililitre Xal stok solüsyonunu temel boyama solüsyonu ile 1:40 oranında seyrelterek kullanıma hazır Xal solüsyonunu taze olarak hazırlayın ve kaptaki örneğe bundan en az 10 mL ekleyin. Akciğeri bir gazlı bez parçasıyla daldırın. Hava değişimine izin vermek için kapağı gevşekçe kapatın ve ışıktan koruyarak 37 °C'de üç ila beş saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından xal çözeltisini uzaklaştırın. Kalan xal çözeltisini temizlemek için akciğerleri bir kez PBS ile yıkayın ve PBS içinde %4 paraformaldehitten en az 10 mililitre ekleyin. Doku artık histoloji için hazırdır ve dört santigrat derecede %4 PFA içerisinde uzun süre saklanabilir.

Bir gömme kalıbının üçte birini seyreltilmemiş poly forze gömme ortamı ile doldurarak başlayın. Ardından akciğer lobunu kalıba yerleştirin ve lob tamamen kapanana kadar ortam eklemeye devam edin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin, ardından gömülmüş lobu 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, gömülmüş akciğerleri kuru buz ve izopentan karışımında yavaşça dondurarak kesime hazırlayın. Gerekirse, örnekler saklanmak üzere -80 °C dondurucuya aktarılabilir; bir kriyostat kullanarak lobdan 7 ila 10 µm kalınlığında kriyokesitler kesin ve kesitleri ticari olarak temin edilebilen kriyokesit hazır lamlarına monte edin. Montaj işleminin ardından, kesitleri nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de 24 saat boyunca XAL boyama çözeltisinde inkübe edin. Ertesi gün, lamları PBS ile her seferinde beş dakika olacak şekilde iki kez durulayın.

Bunu, distile su ile kısa bir durulama ile takip edin. Şimdi, xal'i daha baskın hale getiren hafif bir karşıt boyama elde etmek için lamları 10 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı (nuclear fast red) ile karşıt boyayın ve karşıt boyayı hemen distile su ile durulayın. Daha koyu bir karşıt boyama için süreyi 30 saniyeye veya daha fazlasına çıkarın.

Slaytları immüno mount ile kapatın. Done LM eight fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelendi. Burada açıklanan, aynı anda laxy transduce edilmiş ve transduce edilmemiş kontrol done ve LM eight hücrelerinin enjekte edildiği farelerin perfüze ve perfüze edilmemiş akciğerlerinin temsilci görüntüleri ile kontrol done hücreleri enjekte edilen farelerin görüntüleri kullanılmıştır.

Perfüze edilmemiş ve perfüze edilmiş akciğerlerde makroskobik ve mikroskobik metastazlar saptanamadı. Ancak ilginç bir şekilde, dun LA Z hücreleri enjekte edilen farelerde, xgl boyaması perfüze edilmemiş akciğerlerin yüzeyinde tek hücrelerden veya küçük hücre kümelerinden oluşan mavi mikrometastatik odakları ortaya çıkardı; akciğerlerin in situ perfüzyonu ve fiksasyonu, dun la z mikrometastazlarının tespit edilebilirliğini daha da artırdı, ancak kontrol LM sekiz hücreleri enjekte edilen farelerde makroskobik odaklara doğru bir büyüme gözlenmedi. Perfüze edilmemiş akciğerlerde, çapı 0,1 milimetreden büyük, yarı saydam ve zar zor tespit edilebilen makrometastatik odaklar belirlendi. Akciğerin perfüzyonu, odakların tespitini iyileştirmedi.

Buna karşın, LAC Z hücreleri enjekte edilen farelerde, perfüzyon uygulanmamış organların yüzeyinde X gal ile maviye boyanmış çok sayıda makro metastaz tespit edilmiştir. Perfüzyon uygulanmamış organların yüzeyinde mikro metastazlar da saptanmıştır. Ayrıca, akciğerlerin perfüzyonu, makro ve mikro metastazların tespit edilebilirliğini daha da artırmıştır.

Sonuç olarak, temel olarak perfüze dokunun şeffaflığı sayesinde mikro ve makro metastazlar daha yüksek bir yoğunlukta ve daha fazla sayıda görünür hale gelmiş, böylece organ yüzeyinin altındaki odakların görünürlüğü de artmıştır. Akciğer dokusunun kriyoseksiyonları kullanılarak yapılan ek bir histolojik analiz, LAX Z transduksiyonlu don ve LM sekiz hücreleri enjekte edilen farelerde ve Dun LAX Z hücrelerinden türetilen primer tümörleri olan farelerde akciğer metastazlarının tespit edilebilirliğinin arttığını doğrulamıştır. Akciğer kesitlerinde mikro metastazlar, hatta tek hücreli odaklar tespit edilmiştir.

Bu durum, ilgili kontrol hücrelerinin primer tümörlerine sahip farelerde gözlemlenmemiştir. Dahası, makro metastazlar, LM eight LA C hücreleri enjekte edilen farelerde, kontrol LM eight hücrelerine sahip hayvanlara kıyasla daha belirgin şekilde görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, ZI iki'de akciğer perfüzyonu ve fiksasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ve ardından çıkarılan akciğerlerdeki metastazların exci boyamasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, her türlü kanser çalışmasında akciğerdeki metastaz dağılımı için oldukça hassas bir son nokta ölçümüdür ve ayrıca metastatik lezyonların erken teşhisinde kullanılan mikro BT, PET ve MRI gibi mevcut in vivo görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için bir referans noktası olarak hizmet edebilir.