Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, altın nanopartikül tabanlı bir hücre hareketliliği testi kullanarak hücresel hareketliliği zaman içinde nicel olarak ölçebilmektir. Bu işlem, öncelikle cam lamellerin altın nanopartikül kaplaması için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Spesifik olarak, endotoksin içermeyen lameller jelatin ile kaplanır ve ardından fırınlanır.

İkinci adım, altın nanopartikülleri oluşturacak olan kloroaurik asidin indirgenmesi ve jelatin kaplı lamellerin çözelti ile eşit şekilde kaplanmasıdır. Ardından, hücreler deney için istenen süre boyunca altın nanopartikül kaplı lamellerin üzerine yerleştirilir. Devamında, jelatin altın nanopartikülleri yerinden oynatarak izler oluşturacaktır.

Son adım, hareket eden hücrelerin oluşturduğu izleri görüntülemek için mikroskopi kullanarak hücre hareketliliğinin izlenmesi ve miktar tayininin yapılmasıdır. Nihayetinde, izlerin alan ölçümleri ücretsiz olarak sunulan yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu tekniğin, zaman aşımı görüntüleme (time lapse imaging) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajlarından biri, bu deneyin yalnızca standart bir ışık mikroskobu ve standart bir kamera gerektirmesi ve ücretsiz görüntüleme yazılımları kullanmasıdır.

Ayrıca, bu analiz yöntemi, yüksek kapasiteli tarama yapabilen bir metodoloji kullanarak çok sayıda örneğin kolayca analiz edilmesine ve karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu yöntem, farklı fizyolojik faktörlerin ve hücre hareketinin etkileri hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, patojenlerin enfekte hücrelerin motilitesi üzerindeki etkilerine yönelik çalışmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, protokolde belirtilen hacimlerin ve sıcaklıkların kesinlikle takip edilmesini gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Bu protokolde, başarının sağlanması için çöktürülmüş altın nanoparçacıkların nihai çözeltisinin renginin değerlendirilmesine vurgu yapılmıştır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır; çünkü FGO kinetik iz hareketliliği analizi adımlarının öğrenilmesi zordur.

Bunlar, hücresel ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmayan birkaç prosedür içermektedir. Jelatin kaplı lamel hazırlamak için, öncelikle çözeltinin final konsantrasyonu 300 mililitrede 0,5 gram olacak şekilde jelatin ve deiyonize suyu yeniden süspande edin, ardından karışımı 15 ila 30 dakika boyunca otoklavlayın. Bu işlemin, jelatin eklendikten sonraki iki saat içinde bir doku kültürü kabininde yapılması önemlidir.

Öncelikle sekiz veya dokuz adet asitle yıkanmış lamelin 100 milimetrelik plastik bir kaba aktarılmasıyla kaplama için lameller hazırlanır. Lamellerin birbirine veya kabın kenarlarına temas etmediğinden emin olun. Plaka üzerine taşmamasına dikkat ederek, her bir lamelin üzerine pipetle dikkatlice iki ila üç damla jelatin damlatın.

Ardından, jelatin kaplı lamelleri içeren kabı bir fırına yerleştirin ve 90 °C'de 10 dakika boyunca bekletin. 10 dakika sonra, kabı fırından çıkarın ve tekrar doku kültürü kabinine geri yerleştirin.

Fazla jelatini pipetle nazikçe çekin. Kabı fırına geri yerleştirin ve lamel camları 70 °C'de 45 dakika boyunca kurutun. Lamel camlar kuruduktan sonra, kabı fırından çıkarın ve doku kültürü kabinine geri koyun.

Steril bir iğneyi nazikçe kullanarak lamelin bir kenarını kaldırın. Ardından, jelatin kaplı lamelleri kaptan çıkarmak için steril cımbız kullanın ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Bir sonraki adım, kolloidal altın kaplı lamelleri hazırlamaktır.

Doku kültürü kabininde çalışarak, steril ve endotoksin içermeyen bir erlenmeyer flask içerisinde 1,5 mililitre 14,5 millimolar kloro ORIC asit çözeltisi ve 13,5 mililitre otoklavlanmış deiyonize suyu birleştirip 10 mililitre %0,5 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayarak başlayın. Her sekiz ila dokuz lamel için sonuç, soluk sarı bir çözelti olmalıdır. Kloro ORIC asit toksiktir ve dikkatle taşınmalıdır. Ayrıca ışığa duyarlıdır, bu nedenle kaynatma adımı düşük ışıklı bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

Çözelti kaynama noktasına ulaştığında, balonu ısıtıcı plakadan alın ve bir manyetik karıştırıcıya aktarın. Çözelti içinde kolloidal altın partikülleri oluşturmak için, karıştırma işlemi sırasında her 15 mililitre kloro AURIC asit çözeltisi başına 0,7 mililitre %0,5 sodyum sitrat çözeltisi ekleyin ve yaklaşık iki dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Bu süre zarfında çözelti, soluk sarıdan şeffafa, ardından griye, mora ve derin mora dönüşecektir.

Çözelti nihayet kırmızı şarap veya tercihen pas rengine ulaşmadan önce, kolloidal altın çözeltisini 10 mililitrelik bir pipete çekin ve çözeltinin oda sıcaklığına gelmesi için pipet içerisinde bir ila iki dakika soğumasını bekleyin. Ardından, 24 kuyucuklu plaktaki jelatin kaplı lamel üzerine 0.5 ile bir mililitre arası ekleyin. Kolloidal altın kaplı lamelleri içeren 24 kuyucuklu plağı 37 degrees Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Partiküllerin jelatin kaplı lameller üzerine çökelmesi için yeterli süre geçtikten sonra, yoğunluklarını bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.

Altın nanoparçacıklarının uygun dağılımı, güneş kamyonlarının kenarlarının kolayca ve verimli bir şekilde ayırt edilmesine yardımcı olur. Optimal yoğunluk, hücre boyutuna göre değişiklik gösterir. Altın parçacıklarının çok yüksek bir konsantrasyonu hücrelerin hareket kabiliyetini engellerken, altın parçacıklarının çok düşük bir konsantrasyonu ise doğru bir mobilite izi belirleme yeteneğini sınırlar.

Bu nedenle, münferit deneylerde yalnızca aynı partide üretilmiş veya aynı yoğunluğa sahip olduğu doğrulanmış lameller birlikte kullanılmalıdır. Altın partikül konsantrasyonu yetersizse, jelatin kaplı lamellere 0,5 ile bir mililitre arasında ek kolloidal altın çözeltisi ekleyin. Ancak, burada gösterildiği durumdaki gibi altın partikül konsantrasyonu çok yüksekse, tek etkili seçenek kolloidal altın çözeltisini yeniden hazırlamak ve yeni lamelleri kaplamaktır.

Partikül yoğunluğu uygunsa, plakayı 37 °C'deki inkübatöre geri yerleştirin ve bağlanmamış altın partikülleri uzaklaştırmak için lamelleri steril fosfat tamponlu saline üç kez daldırarak bir saatten gece boyunca sürecek şekilde inkübe edin. Ardından, koloidal altın kaplı lamelleri, kullanılmaya hazır olana kadar temiz bir 12 kuyucuklu plakanın PBS dolu kuyucuklarında 4 °C'de saklayın. Lamellerin kurumasına izin verilmemeli ve hazırlandıkları tarihten itibaren iki ila üç ay içinde kullanılmalıdır.

Bir sonraki adım, hücre kültürü için kolloidal altın kaplı lamel hazırlığıdır. İşleme, lamelleri eklemeden önce yaklaşık 0,3 mililitre kültür ortamı eklenmiş olan 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirerek başlayın. Her bir kolloidal altın kaplı lamel üzerine yaklaşık 5.000 ila 50.000 hücre aktarın. Hücre sayısı hücre tipine göre değişiklik gösterecektir, ancak hücre yoğunluğu, aynı alandaki birden fazla hücreden kaynaklanan hücre izlerinin üst üste binmesini önleyecek kadar düşük olmalıdır.

Plakayı kapatın ve 37 °C sıcaklıkta, %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre altı ila 24 saat boyunca yerleştirin. Hücre tipinin motilitesine bağlı olarak, optimal zaman aralığı her hücre tipi için deneyle belirlenmelidir. İnkübasyonun ardından, hemen analiz edilmeyecek olan lamelleri önce iki kez PBS'ye daldırarak, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 paraformaldehid içinde inkübe ederek sabitleyin. Sabitlenmemiş veya sabitlenmiş lameller üzerinde, tek bir hareketli hücre tarafından oluşturulan izlerin görüntülerini bir ışık mikroskobu kullanarak yakalayın. Hücresel izlerin fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme, hücre tipine göre değişiklik gösterir. Ancak, sonuçları karşılaştırabilmek için her çalışmada aynı büyütme kullanılmalıdır.

Monositler için, ImageJ, JNIH image veya image tool gibi ücretsiz olarak erişilebilen yazılımlar kullanılarak 40x büyütme iyi sonuç verir; her örnek için yakalanan görüntülerden 10 ila 20 veya daha fazla hücrenin temizlediği kolloidal altın ortalama alanını belirleyin. Burada gösterilen, 40x objektif ile çekilmiş, tek bir uyarılmamış monosit tarafından temizlenen kolloidal altın partikül yolu örneğidir. Hareketli olmayan hücreler, çevrelerinde düşük seviyeli bir hareketliliğe işaret eden karakteristik küçük oval veya daire şeklinde izler oluştururlar. Buna karşılık, yüksek hareketliliğe sahip hücreler, düzensiz şekilleri nedeniyle uzamış izler ve daha geniş toplam alanlar şeklinde yönlü bir hareketle karakterize edilirler.

Hücre izleri, hacimlerini belirlemek için Image J yazılımındaki serbest çizim (freehand) aracı kullanılarak en iyi şekilde analiz edilir. Ardından, Image J'nin analiz menüsündeki ölçüm aracı kullanılarak kantitatif alan ölçümleri gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, sapmalar nihai sonuçları güçlü bir şekilde etkileyebileceği için protokolde belirtilen hacimlere ve sıcaklıklara kesinlikle uyulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, jelatin kaplı lamel camların nasıl hazırlanacağı, altın nanopartiküllerin ve altın nanopartikül kaplı lamel camların nasıl hazırlanacağı ile ışık mikroskobu kullanılarak hücre hareketinin nasıl izleneceği ve kantitatif olarak değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Sıcak tabla üzerinde kaynayan solüsyonlarla çalışmanın, özellikle de florür, AIC asidi ve sodyum sitratın kaynayan solüsyonlarından çıkan buharların tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken çeker ocakta çalışmak ve sağduyulu davranmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.