Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mühendislik ürünü bir insan bağışıklık sistemi taşıyan fareler üretmektir. Bu işlem, öncelikle farenin cerrahiye hazırlanması ve ardından ikinci adımda trokarın bir timus parçasıyla doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Matrigel, CD 34 negatif ve CD 34 pozitif transduksiyon yapılmış hücrelerle karıştırılır ve ardından bu karışım trokara eklenir.

Sıradaki adımda, matrigel konstrüktleri böbrek kapsülü altına nakledilir. Nihayetinde, genetik olarak mühendisliği yapılmış CD8 T hücreleri tarafından hedef tümörlerin reddi, canlı PET görüntüleme ve fiziksel tümör ölçümleri ile izlenebilir. Bu tekniğin, tam nöron modelleri gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, bu yöntemin genetik olarak modifiye edilmiş insan kök hücre gelişiminin insan timusunda incelenmesine ve türetilen soyların ardından in vivo etkinlik testlerinin yapılmasına olanak tanımasıdır; prosedür laboratuvarlarımızdan üç teknisyen, Gregory Bristol, Bernard Levin ve Sean Kim tarafından gerçekleştirilecektir.

Bu şematik diyagramda, mart-1 spesifik T hücreleri taşıyan kimerik farelerin üretimi için bu çalışmalarda kullanılan modifiye BLT modeli özetlenmiştir. Timus implantı, otolog fetal karaciğerden izole edilen transdukse ve transdukse edilmemiş CD34 hücrelerinden yeniden oluşturulur. Transdukse edilen hücrelerin bir kısmı dondurulur ve dört ila altı hafta sonra ışınlanmış farelere enjekte edilir.

Bu videoda, hayvanlar anesteziden dolayı uyuşuk hale geldiğinde, canlı konstrüktün implantasyonu gösterilmektedir. İlk olarak, her bir farenin sol tarafını kalçadan omuza kadar, sırtın merkezi ile göbek arasından tıraş edin. Her hayvanın ağırlığını kaydettikten sonra, numaralandırma için kulaklarına delik açın ve her birinin omzuna deri altına 0,3 milliliters carprofen enjekte edin.

Ardından fareleri, sol tarafa bakacak şekilde sağ yanları üzerine yatırın. Şimdi, yuvarlak törpü uçlu 16 gauge bir kanser implantı iğnesinin trokarını PBS ile yıkayın. Bir çift karga burnu pens kullanarak, PBS kabına bir parça timus ekleyin ve ardından trokarı çubukla birlikte yatay tutun.

Dokuyu ucun hemen içinden aspire edin. Trokarı böbrek kapsülünün altına kaydırmak ve dokuyu enjekte etmek, bu prosedürün en zorlu yönlerinden biridir. Ardından, bir yardımcıdan destek alın.

Beş mikrolitre soğuk matrigel'i, nazikçe karıştırarak hücrelerin bulunduğu bir tüpe eklemek için pozitif yer değiştirme özellikli bir pipet kullanın. Trokarı yatay konumda tutun. Yardımcı matrigeli pipetlerken, çubuğu yavaşça geri çekin.

Her fare için trokarı karıştırın. Öncelikle, hayvanın çıplak derisini Betadine ile silin ve ardından izopropanol mendil ile temizleyin. Dalağın konumunu belirten deri altındaki en koyu noktayı iki kez tespit edin.

Böbrek üzerindeki deriyi kaldırmak için künt forseps kullanılarak, dalağın yaklaşık beş milimetre dorsalinde bulunur. Deride, dalağa paralel, yaklaşık 15 milimetre uzunluğunda bir kesi yapın. Altındaki periton kas tabakasında da benzer bir kesi yapın.

Erkeklerde böbrek doğrudan görünür olmalıdır. Böbreğin dışarı çıkmasını sağlamak için karnı hafifçe sıkın. Dişilerde böbreğin açık kalması için sol elle karna baskı uygularken, önce yumurtalığı tutmak için bir hemostat kullanın ve ardından organın vücut dışında kalmasına yardımcı olmak için böbreği dışarı çekin.

Böbrek kapsülünün arka ucunda küçük bir delik açın ve ardından trokarı bu delikten içeriye, trokarın ağzı böbrek kapsülü tarafından tamamen örtülene kadar böbrek boyunca kaydırın. Daha sonra sağ elinizin küçük parmağını kullanarak dokuyu enjekte edin. Şimdi, kapalı hemostatı kullanarak böbreği nazikçe eski yerine itin.

Peritona çift düğümlü tek bir dikiş atarak cildi bir kese gibi sıkıştırın ve ardından iki adet yara klipsi yerleştirin. Son olarak, her göze bir damla PBS damlatın ve fareyi bir kafes içinde, altlığın üzerine yan yatırın. Tüm farelere aynı şekilde implantasyon yaptıktan sonra, hayvanları başlarında bırakmadan önce karınlarının üzerine yatacak şekilde geri döndüklerini onaylayın.

Bu ilk şekil, humanize farelerde THI canlı implantının temsilci bir görüntüsünü göstermektedir. Bu şekilde, timik dokunun normal gelişimi ve insan CD4 ve CD8 pozitif T hücrelerinin fizyolojik doku dağılımı gösterilmektedir. Rekonstitüsyon sonrası hayvanlar, normal CD4 ve CD8 pozitif T hücresi dağılımına sahip bir insan bağışıklık sistemini taşımaktadırlar.

Burada melanoma tümörü taşıyan bir fareye ait temsili bir görüntü gösterilmektedir. Gri alanlar CT tarama görüntüsünü belirtmektedir. Renkli alanlar, PET taraması ile tespit edilen tümörün metabolik aktivitesini göstermektedir.

Bu deneyde tek başına yapılan BT taraması, beyaz daire ile belirtilen bölgede büyük bir tümör kütlesi olduğunu göstermiştir. Ancak, in vivo PET görüntülemesinin ortaya koyduğu üzere, bu alan çoğunlukla nekrotik ve skar dokusundan oluşmaktadır; bu durum, tümör regresyonunu ve temizlenmesini değerlendirmek için PET görüntülemenin daha hassas ve doğru bir yöntem olarak faydasını vurgulamaktadır. Bu prosedürün ardından, T hücresi fonksiyonu ile ilgili soruları yanıtlamak için T hücresi analizi, fenotipleme ve ex vivo aktivasyon gibi diğer deneyler gerçekleştirilebilir.