Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, periferik sinir sistemi ganglionlarından saflaştırılmış nöronal progenitör popülasyonu elde etmektir. Bu işlem, öncelikle fetal farelerden ilgili organın veya spesifik ganglionların diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından dokular, tekil hücreleri çevreleyen ortama salmak için kısmen dissosiye edilir.

Ardından, kalan doku kümelerini veya büyük agregatları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonu filtrelenir. Son olarak, hücre popülasyonundaki floresan raporer ekspresyonuna dayanarak ilgili popülasyonu izole etmek için hücre süspansiyonuna akış sorting (flow sorting) uygulanır. Nihayetinde, gelişimin farklı aşamalarında izole edilen progenitörler arasında veya farklı nöronal hücre tiplerinin saflaştırılmış popülasyonları arasında gen ekspresyon modelleri karşılaştırılabilir.

Bu tekniğin, antikor etiketlemesine dayalı hücre popülasyonu izolasyonuna göre temel avantajı, genellikle uygun immüno reaktiflerin bulunmamasıdır. Belirli bir geni eksprese eden hücreleri etiketleyen, ayrı nöronal alt kümelerde floresan protein üreten genetik olarak mühendisliği yapılmış fare hatları, bu hücre popülasyonlarının izole edilmesine olanak tanır. Biz bu yöntemi bağırsaktan ve ağzın nörojenik hattından nöral progenitörlerin izolasyonu için göstermiş olsak da, yöntem floresan raporlayıcılar eksprese eden diğer model sistemlere de uygulanabilir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, kaynak dokuları aşırı sindirme eğiliminde oldukları ve bunun sonucunda hücre canlılığının kaybolduğu için zorluk yaşarlar. Disseksiyona başlamadan önce, ilgili yapıların odakta olduğundan emin olmak için embriyoları parlak alan aydınlatmasıyla inceleyin. Ardından, floresan stereo mikroskop kullanarak floresan raporer ekspresyonunu tarayarak transgen pozitif embriyoları belirleyin.

Ötanazi işleminden sonra, dokular diseke edilirken embriyonun yüzmemesi için diseksiyon kabına minimum miktarda PBS eklenerek işleme başlanır. Embriyonun derisini vücudun yanları boyunca ve karın bölgesinde karaciğer seviyesinden açın. Embriyoyu sırt üstü çevirin ve sabitlenmesi için ince pensler kullanın.

Ön üyeler seviyesinde, diyafram hizasından başka bir pens çifti yerleştirin ve ardından hızla çekin. Karın organlarını, karaciğerden genital tüberküle kadar olan viscera kısmını çıkarmak için kuyruk yönüne ve dorsal vücut duvarından uzağa doğru çekin. Kalp veya akciğerler gibi torasik boşluktan gelen herhangi bir organ viscera ile birlikte çıkarsa, daha ileri gitmeden önce bunları temizleyin.

Abdominal viseralar karkastan ayrıldıktan sonra, karaciğerin altına, mideye yakın bir yere bir pens yerleştirin ve karaciğeri bağırsaktan nazikçe ayırın. Ardından arka bağırsağı dorsal üretra ile dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ürogenital sistemden uzaklaştırın. Son olarak, dalak midenin altında görünecek şekilde bağırsağı ters çevirin.

Dalak ve pankreası çıkarın. Mezenterden tutarak bağırsak kıvrımlarını birbirinden ayırın. Ardından, mezenteri nazikçe çekerek mezenteri ve beraberindeki damar yapısını bağırsaktan sıyırın.

Bağırsağı pensle doğrudan tutmaktan kaçının. Eğer bağırsak koparsa, ayrıştırma aşamasında ayrılan parçaları bir araya getirin. Her doku tipini, doku tipine ve embriyo fenotip tipine göre, buz gibi soğuk HBSS içeren 15 mililitrelik konik tüplerde birleştirin.

Pelitleme işleminden sonra, alt diseksiyonla ayrılmış dokulardaki HBSS mümkün olduğunca aspire edilir. Ardından doku peleti bir ila birkaç mililitre ACU max içerisinde yeniden süspanse edilir. Her örnek arasında pipet uçları değiştirilmelidir.

Doku türlerinin çapraz kontaminasyonunu önlemek için tüpleri 20 ila 45 dakika boyunca 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. İzole edilen dokunun evresine bağlı olarak, dokunun aşırı disosiyasyonunu ve buna bağlı olarak düşük hücre canlılığını önlemek adına, dokunun disosiyasyonu ve filtrelenmesi prosedürün en kritik kısmıdır.

Disosyasyon süresini sınırlayın ve işlemin yarısında tüm doku parçalarını tamamen disosyete etmeye çalışmayın. Disosyasyon süresinin sonunda, tüpü su banyosunun kenarına kuvvetlice vurup bileğinizi hızlı bir hareketle aşağı doğru savurarak dokuyu manuel olarak parçalayın. Şimdi disosyete edilmiş örnekleri buz üzerine taşıyın ve her bir tüpe, her örnek için yeni bir pipet ucu kullanarak taze hazırlanmış 1 mL quench ekleyin; doku neredeyse tamamen disosyete olana kadar örneği yukarı aşağı pipetleyerek karıştırın.

Şimdi, etanolle sterilize edilmiş bir pens kullanarak, 38 mikronluk naylon ağ membrandan kesilmiş üç santimetrelik bir kareyi yeni bir 15 mililitrelik konik tüpün ağzına yerleştirin. Ardından, tekil resüspanse edilmiş hücre solüsyonunu, dar uçlu pipet uçları kullanarak membranın merkezine pipetleyip ağ üzerinden filtreleyin. Hücre süspansiyonu filtrelendikten sonra, örnek tüpünü bir mililitre quench 1-5 ile durulayın ve kalan tüm hücreleri filtreleyin.

Ardından, filtrelenmemiş doku örneklerinin tüpe girmemesine dikkat ederek membranı çıkarın. Peletleme işleminden sonra, hücre süspansiyonlarının süpernatanını aspire edin ve peleti bir mililitre quench 1-5 içerisinde yeniden süspande edin. Daha sonra, her bir hücre süspansiyonunu az önce gösterildiği gibi bir naylon ağ aracılığıyla beş mililitrelik polistiren tüplere filtreleyin.

İşe, sadece EGFP kompanzasyon kontrolü için floresan örnekten küçük bir alikot ayırarak başlayın. Ardından, yabani tip doku örneğini iki porsiyona ayırarak birini sadece yabani tip, diğerini ise seven A a d.Only olarak etiketleyin. Şimdi tüm örnek tüplerini quench 1'den 5'e kadar doldurun ve örnekleri çöktürdükten sonra her tüpteki süpernatantın son 200 µL dışındaki kısmını aspire edin.

Son olarak, sıralanacak örneklere ve yalnızca seven a a d kontrolüne seven a a d ekleyin. Ardından, 1,5 ml'lik mikro santrifüj örnek toplama tüplerine 0,75 ml triazole LS ekleyin. Kompanzasyon parametrelerini ve kapıları ayarlamak için kontrol örneklerini kullanarak işleme başlayın; böylece seven A a d pozitif ölü hücrelerden kaçınılabilir ve yüksek GFP floresans yoğunluğu sergileyen hücreler toplanabilir.

Kompanzasyon parametrelerini ayarladıktan sonra, geniş çaplı bir nozul ve düşük akış hızıyla, mümkün olan en düşük basınçta ayıklamaya başlayın. Triol LS'nin aşırı seyreltilmemesi için her bir mikro santrifüj tüpüne en fazla 25,000 hücre toplayın. Ayıklama işleminin hemen ardından, triol LS içinde yakalanan hücrelerin bulunduğu her tüpü vorteksleyin.

Bu ilk şekilde, koitustan 15,5 gün sonraki bir tam monte Euro genital kanalı, parlak alan aydınlatması altında ventral görünümde gösterilmiştir. Aynı örnek, TH EGFP transgen ekspresyonu ile tanımlanan adrenal ve medial yerleşimli çölyak ganglionlarındaki EGFP pozitif hücrelerin dağılımını göstermek için floresan aydınlatma altında incelenmiştir. Koitustan 15,5 gün sonraki TH EGFP sub-disekte mesanenin bu lateral görünümü, pelvik ganglionlarda, mesane duvarında ve üretradaki transgen ekspresyonundan kaynaklanan floresansı göstermektedir.

Aynı hücrelerin bu dorsal görünümünde, anterior dorsal üretra dokusunda EGFP pozitif hücreler belirgindir; akışla ayırma için hücre süspansiyonları üretmek amacıyla yapılan doku disosiasyonu, yeterli enzimatik sindirim ile düşük hücre canlılığına yol açabilecek aşırı sindirimden kaçınma arasındaki hassas bir dengedir. Bu fotomikrograflar, disosiasyon süresinin yarısında olan alt ürogenital kanal ve intestinal dokuları göstermektedir. Uygun şekilde sindirilmiş dokuların manuel işlem öncesi ve sonrası fotoğraflarında görüldüğü üzere, çok uzun süre veya çok yüksek enzim konsantrasyonu ile enzimatik işleme tabi tutulan dokularda, sub-diseksiyonla ayrılmış organ parçaları hala belirgin şekilde görülmektedir.

Bununla birlikte, elde edilen süspansiyon herhangi bir kalıntı büyük doku parçası içermez; uygun disosiyasyon ve manuel filtreleme, tipik olarak %90'dan fazla canlı hücre ve bu canlı popülasyon içinde reporter ifade eden hücreler içeren akış sitometrisi profilleri üretir; bu hücreler yüksek yoğunlukta EGFP ekspresyonu korurlar. Siyah popülasyon, ölü olan ve 7-AAD floresan boyasının alınımıyla işaretlenmiş tekil hücrelerden oluşur. Gri popülasyon ise, ileri ve yan saçılıma göre 7-AAD'yi dışlamış olan ve dolayısıyla canlı olan tekil hücrelerden oluşur.

Yeşil popülasyon, kapılı GFP pozitif alanından elde edilmiştir ve yedi A a d'yi dışlayan ve EGFP floresansı sergileyen tek canlı hücrelerden oluşur. Bu prosedür ile, popülasyonlar arasındaki gen ekspresyon profillerindeki farklılıklar veya farklı soyların gelişimi hakkındaki soruları yanıtlamak amacıyla, sempatik zincir, dorsal kök ganglionları veya akciğer gibi diğer periferik dokulardan nöronal progenitörlerin izolasyonu gerçekleştirilebilir.